Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Özet

Bu prosedür, Gen Verici MXcell elektroporasyon sistemi hızlı ve kolay bir fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) veya diğer birincil hücreler için en iyi elektroporasyon koşulları belirlemek için nasıl kullanılacağını gösterir. Sorun giderme için dikkat edilmesi gereken noktalar da ilgili video tartışılmıştır.

Özet

Elektroporasyon birincil hücre içine plazmid DNA veya siRNA tanıtmak için en etkili yolu olduğu giderek daha belirgin hale gelmektedir. Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve Gen Verici elektroporasyon tampon (Bio-Rad), özellikle memeli hücrelerinde ve birincil ve kök hücreleri gibi zor transfect hücreleri, nükleik asitler kolayca transfect için geliştirilmiştir. Biz iyi elektroporasyon koşulları hızla tanımlamak için basit bir deney gerçekleştirmek için nasıl göstereceğiz. Biz bir deney optimizasyonu yapılır aynı zamanda yapılabilir, böylece elektroporasyon koşulları bir dizi yoluyla çeşitli örnekleri çalıştırmak için nasıl göstereceğiz. Biz de en uygun koşulları, aynı elektroporasyon verimliliği korurken, standart elektroporasyon küvetler kullanılabilir 96-iyi elektroporasyon plakaları kullanarak elektroporasyon küvetler elektroporasyon plakalardan geçiş kolaylaştırmak tespit nasıl gösterecektir. Video, elektroporasyon deneyler başarı ya da başarısızlığa yol açabilecek bazı önemli faktörler de ele alınacaktır.

Protokol

1) Hücre hazırlık

1. Yapışık hücrelere kullanırken, trypsinize ve elektroporasyon önce hücreleri toplamak için gereklidir.
2. Üç farklı geçit numaraları temsil eden dört fare embriyonik fibroblast (MEF) kültürleri, arasında transfeksiyon karşılaştırmak için, her bir şişesi aşağıdaki gerçekleştirin.
3. Hücre kültür ortamı aspire.
4. Hücreleri yıkamak için PBS ekleyin.
5. PBS çıkarın; hücreleri kapsayacak şekilde yeterli tripsin ve tripsin hücreleri ayırmak için izin vermek için birkaç dakika bekleyin.
6. Hücrelerin durumunu doğrulamak için bir mikroskop ile şişeler kontrol hücreleri ayırmak için balon şaplak ve sonra, emin hücreleri tüm müstakil olmak için tekrar şişeyi kontrol edin.
7. Ek süre ve gerekirse tekrar bekleyin.
8. Tüm hücreleri müstakil sonra, tripsin nötralize etmek için serum içeren medya ekleyin.
9. Hücrelerin bir santrifüj tüpüne aktarın ve santrifüj yoluyla pelet hücreleri (RCF = 300 xg).
10. PBS bilinen bir ses supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
11. Hücreleri saymak.
12. Uygun hacimli hücre süspansiyonu, deneyler için hücreler (1 x ¹⁰ 6 hücre / mL yoğunluğu hücreleri de ortalama 150 mcL gerekecektir) gerekli sayıda sağlamak için yeni bir tüpe aktarın .
13. Santrifüj hücreleri.
14. Gene Verici elektroporasyon 1 x 10 ⁶ hücre / mL bir hücre yoğunluğu elde etmek için tampon uygun hacmi supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın.
15. Hücre süspansiyonu plazmid başına mL 20 mg ekleyin ve hafifçe karıştırın.

2) Elektroporasyon damar kurulum ve elektroporasyon

Plaka kurulum ve elektroporasyon

1. Gene Verici MXcell elektroporasyon sisteminin güç modülü takın plaka odası.
2. Pipet 150 mcL hücre karışımı ya da 96-kuyu elektroporasyon plaka kuyu içine tampon.
3. Plaka odası ve nabız plaka koyun.
4. Odasından plaka çıkarın.
5. Her bir kuyunun içinde yukarı ve aşağı pipetleme iyi içeriği karıştırın.
6. Hücrelerin her kuyudan 12 kuyucuğu önceden ısıtılmış tampon aktarın.
7. Plaka dokunun hücreleri dağıtmak ve inkübatörde koymak.
8. Hücreler 24 saat kurtarmanızı sağlar.

Küvet kurulum ve elektroporasyon

9. ShockPod Gene Verici MXcell elektroporasyon sistemi ve fiş ™ küvet kamara güç modülü plaka odasına çıkarın.
10. Pipet 600 mcL 0.4 cm boşluk elektroporasyon küvet içine hücre süspansiyonu.
11. ShockPod odasına küvet koyun ve elektrik darbe sağlamak.
12. Küvet odasından çıkarın.
13. Küvet içinde yukarı ve aşağı pipetleme küvet içeriğini karıştırın.
14. Hücrelerin her kuyudan 12 kuyucuğu önceden ısıtılmış tampon aktarın.
15. Plaka dokunun hücreleri dağıtmak ve inkübatörde koymak.
16. Hücreler 24 saat geri alalım.

3) Temsilci Sonuçlar

Hücreleri transfecting ve onları kurtarmak için izin sonra, flow sitometri kullanarak epifluorescent mikroskopi kullanılarak kantitatif, kalitatif transfeksiyon verimlilik, analiz ve.

Şekil 1. başarıyla electroporated ve şimdi, GFP geninin ifade Hücreler epifluorescent mikroskobu altında görünür.

Şekil 2 faz kontrast altında hücreleri görüntüleme hem transfekte ve untransfected hücrelerinin görselleştirme sağlar. Bunlar 200V düşük voltaj elektroporasyon darbe maruz kaldılar hücrelerdir. Hücreler yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle büyük ölçüde konfluent.

Şekil 3, Epifloresans altında bakış aynı alanda bir dizi hücreleri GFP işaretleyici ifade gösterir, ama bu sadece küçük bir yüzdesi önceki resim görünür hücreleri .

Şekil 4 250V, faz kontrast altında görülen canlı hücrelerinin toplam sayısı biraz azalır.

Epifloresans altında bir Şekil 5 GFP ifade hücrelerinin sayısının arttığını görebilirsiniz.

Şekil 6, en yüksek voltaj 375V uygulanan, daha az görünür canlı hücreler vardır.

Şekil 7 Ancak, geri kalan hücreler büyük bir yüzdesi, GFP ifade edilmektedir. Hangi durum optimal deney tasarımı bağlıdır. Bazı deneylerde transfekte hücrelerinin en büyük sayı diğer deneylerde en yüksek yüzde transfeksiyon belki de en iyisi, en uygun olabilir.

Biz her koşul altında olumlu GFP ve yüzdeleri hücre yaşla birlikte değişir hücrelerin yüzdesi olarak ilgilenen. Flow sitometri, her farklı elektroporasyon koşullar altında transfeksiyon sonuçları hakkında kantitatif bilgi sağlayabilir.

Şekil 8 12 elektroporasyon koşulların her birinin altında 5 hücre gösterilen pasajda olumlu GFP hücre yüzdesi. Durumu 12, maksimum transfeksiyon yüzdesi güçlü kare dalga darbe altında yüksek voltaj üstel çürüme darbe, durumu 6 ve% 70 altında yaklaşık% 80, test.

Şekil 9 hücrelerin elektroporasyon önce 9 kez geçti, transfeksiyon yüzde genel desen neredeyse aynıdır, ancak çok hafif bir azalma ile transfeksiyon yüzdeleri.

Şekil 10 Burada gösterilen geçit genç hücrelere göre transfeksiyon yüzdesinde belirgin bir azalma göstermektedir 13 hücreler, GFP hücrelerinin yüzdeleri. En yüksek transfeksiyon yüzdeleri yaklaşık yarısı, mümkün olduğu kadar kısa sürede izolasyon sonra sağlıklı hücreleri kullanarak önemini gösteren genç hücreleri ne ile elde edildi.

Gene Verici MXcell kullanarak transfecting MEF hücreleri için kullanılan Elektroporasyon Koşullar
Durumu (1-6) Üstel Bozunma bakliyat, 350 uF, 1000ohm	Voltaj (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Durumu (7-12) Kare Dalga bakliyat, 2000 uF, 1000 ohm ve 1 darbe	Voltaj (V)	Darbe Süresi (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Tartışmalar

Bu video makale MXcell elektroporasyon sistemi kolayca MEFS veya diğer birincil hücre hatları için optimal elektroporasyon koşulları belirlemek için nasıl kullanılacağını gösterir. 96-plaka biçimi, pek çok, pek çok ayrı deneyler için ihtiyacını ortadan kaldırabilir aynı anda yapılacak deneysel ya da en iyi duruma getirme koşullarını, çoğaltır için izin verir. Bu yordamı yürütürken, bir, mümkün olduğu kadar kısa sürede izolasyon sonra sağlıklı hücreleri kullanmak ve elektroporasyon tampon eşleştirilir elektroporasyon koşulları kullanmak için hatırlamak gerekir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2674