Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Resumen

Este procedimiento muestra cómo utilizar el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para identificar rápida y fácilmente las mejores condiciones de electroporación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) o de otras células primarias. Consideraciones para la solución de problemas también se discuten en el vídeo asociado.

Resumen

Cada vez es más evidente que la electroporación es la forma más eficaz para introducir ADN plásmido o siRNA en células primarias. El sistema de electroporación Gene Emisores MXcell y Gene tampón de electroporación de impulsos (Bio-Rad) se han desarrollado específicamente para transfectar con facilidad los ácidos nucleicos en células de mamíferos y difíciles de transfectar células, como células primarias y troncales. Vamos a demostrar cómo llevar a cabo un experimento simple para identificar rápidamente las mejores condiciones de electroporación. Vamos a demostrar cómo ejecutar varias muestras a través de una amplia gama de condiciones de electroporación para que un experimento puede llevarse a cabo al mismo tiempo, como la optimización se lleva a cabo. También vamos a mostrar cómo las condiciones óptimas identificados con placas de 96 pozos de electroporación se puede utilizar con cubetas de electroporación estándar, facilitando el cambio de placas de electroporación de cubetas de electroporación, manteniendo la eficiencia de electroporación mismo. En el video, también vamos a discutir algunos de los factores clave que pueden conducir al éxito o fracaso de los experimentos de electroporación.

Protocolo

1) preparación de células

1. Cuando se utilizan las células adherentes, es necesario trypsinize y recoger las células antes de la electroporación.
2. Para comparar la transfección de las cuatro de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) los cultivos, lo que representa tres números diferentes paso, haga lo siguiente en cada frasco.
3. Aspirar de medios de cultivo celular.
4. Añadir PBS para lavar las células.
5. Quitar PBS, añadir tripsina suficiente para cubrir las células, y esperar unos minutos para permitir que la tripsina para separar las células.
6. Compruebe frascos con un microscopio para verificar el estado de las células, justo frasco para separar las células, y luego verifique frasco de nuevo para hacer que las células que están separadas.
7. Esperar más tiempo y repita si es necesario.
8. Una vez que todas las células se separan, añadir el suero que contiene los medios para neutralizar la tripsina.
9. La transferencia de células a un tubo de centrífuga, y precipitar las células por centrifugación (FCR = 300 xg).
10. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en un volumen conocido de PBS.
11. Recuento de células.
12. Transferir a un tubo nuevo el volumen apropiado de la suspensión celular para proporcionar la cantidad necesaria de células para los experimentos (se necesita 150 ml de células por pocillo en una densidad de 1 x 10 ⁶ células / ml).
13. Centrifugue las células.
14. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en la cantidad adecuada de tampón de electroporación Gene generador de impulsos para alcanzar una densidad celular de 1 x 10 ⁶ células / ml.
15. Agregar 20 g de plásmido por mL de suspensión celular y mezclar suavemente.

2) La electroporación configuración de buques y la electroporación

Placa de instalación y electroporación

1. Conecte la cámara de placas en el módulo de potencia del sistema de electroporación Gene Emisores MXcell.
2. Pipetear 150 l mezcla de células o tampón en los pocillos de una placa de electroporación de 96 pozos.
3. Poner la placa en la cámara de la placa y el pulso.
4. Retire la placa de la cámara.
5. Mezclar el contenido y pipeteando arriba y abajo en cada pozo.
6. Transferencia de las células de cada pocillo a pre-calentado de búfer en placas de 12 pocillos.
7. Toque en la placa para distribuir las células y lo puso en la incubadora.
8. Vamos a recuperar las células durante 24 horas.

Cubeta de configuración y electroporación

9. Desconecte la cámara de la placa del módulo de potencia del sistema de electroporación Gene Emisores MXcell y conectar el ShockPod ™ cubeta de la cámara.
10. Pipetear 600 l de suspensión celular en una cubeta de electroporación de 0,4 cm vacío.
11. Ponga la cubeta en la cámara de ShockPod y entregar pulsos eléctricos.
12. Retire la cubeta de la cámara.
13. Mezclar el contenido de la cubeta con la pipeta hacia arriba y abajo en la cubeta.
14. Transferencia de las células de cada pocillo a pre-calentado de búfer en placas de 12 pocillos.
15. Toque en la placa para distribuir las células y lo puso en la incubadora.
16. Vamos a recuperar las células durante 24 horas.

3) Resultados de Representante

Después de la transfección de células y que les permita recuperar, analizar la eficiencia de transfección cualitativamente, mediante microscopía de epifluorescencia, y cuantitativamente, mediante citometría de flujo.

Las células Figura 1. Que han sido exitosamente electroporación y ahora que expresan el gen GFP aparecen bajo el microscopio de epifluorescencia.

Figura 2. Visualización de las células en contraste de fase permite la visualización de las células, tanto transfectadas y transfectadas. Estas son las células que fueron expuestos al pulso de voltaje más bajo de la electroporación en 200V. Las células son en gran parte debido a la confluencia de alta densidad celular.

Figura 3. El mismo campo de visión bajo epifluorescencia muestra una serie de células que expresan el marcador GFP, pero estos son sólo un pequeño porcentaje de las celdas visibles en la imagen anterior.

Figura 4. En 250, el número total de células vivas visto en contraste de fase disminuye ligeramente.

Figura 5. Bajo epifluorescencia, se puede ver que el número de células que expresan GFP se ha incrementado.

Figura 6. En la mayor tensión aplicada, 375V, hay menos células visibles en vivo.

Figura 7. Sin embargo, un gran porcentaje de las células restantes se expresan GFP. ¿Qué condición es óptima depende del diseño experimental. En algunos experimentos con el mayor número de células transfectadas ser óptimo, en otros experimentos de la transfección porcentaje más alto puede ser mejor.

Estamos interesados ​​en el porcentaje de células que son positivas las buenas prácticas agrarias en cada condición y cómo los porcentajes varían con la edad de la célula. La citometría de flujo puede proporcionar información cuantitativa sobre los resultados de la transfección en cada una de las condiciones de electroporación diferentes.

Figura 8. Aquí el porcentaje de células que son positivas las buenas prácticas agrarias en el paso 5 células en cada una de las 12 condiciones de electroporación se muestran. El porcentaje máximo de transfección fue aproximadamente del 80% bajo el impulso de la decadencia máxima tensión exponencial, el estado 6, y 70% en el pulso más fuerte onda cuadrada a prueba, el estado 12.

Figura 9. Con las células pasa nueve horas antes de la electroporación, el patrón general del porcentaje de transfección es casi idéntica, pero con una disminución muy ligera en los porcentajes de transfección.

Figura 10. Aquí se presentan los porcentajes de células GFP en el pasaje 13 células que muestran una marcada disminución en el porcentaje de transfección en relación con las células más jóvenes. Los mayores porcentajes de transfección fueron aproximadamente la mitad de lo que se logró con las células más jóvenes que demuestran la importancia de utilizar las células sanas tan pronto como sea posible el aislamiento.

Las condiciones de electroporación utiliza para la transfección de células MEF utilizando el Gene Pulser MXcell
Condición (1-6) Pulsos exponenciales Decay, todos con más de 350 uF, 1000ohm	(V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Condición (7-12) Plaza de los pulsos de onda, todas ellas con 2.000 uF, 1000 ohm, y el pulso de una	(V)	Duración del pulso (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Discusión

En este artículo de vídeo se muestra cómo utilizar el sistema de electroporación MXcell para identificar fácilmente las condiciones óptimas para la electroporación MEFs u otras líneas de células primarias. El formato de placa de 96 pocillos permite muchas repeticiones de las condiciones experimentales o de optimización para realizar de forma simultánea, lo cual puede eliminar la necesidad de muchos experimentos separados. Mientras lleva a cabo este procedimiento, hay que acordarse de utilizar las células sanas, tan pronto como sea posible después de su aislamiento y las condiciones de uso de la electroporación que coinciden con el buffer de electroporación.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2674