Utilisation du système d'électroporation Gene Pulser MXcell à transfecter des cellules primaires à haut rendement

Résumé

Cette procédure montre comment utiliser le système d'électroporation Gene Pulser MXcell rapidement et facilement d'identifier les meilleures conditions d'électroporation pour les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) ou d'autres cellules primaires. Considérations pour le dépannage sont également abordés dans la vidéo associée.

Résumé

Il est de plus en plus évident que l'électroporation est le moyen le plus efficace pour introduire de l'ADN plasmidique ou siRNA dans des cellules primaires. Le système d'électroporation Gene Pulser MXcell et tampon d'électroporation Gene Pulser (Bio-Rad) ont été spécifiquement développés pour facilement transfecter des acides nucléiques dans les cellules de mammifères et difficiles à transfecter des cellules, telles que des cellules primaires et des souches. Nous allons montrer comment réaliser une expérience simple pour identifier rapidement les meilleures conditions d'électroporation. Nous allons démontrer comment exécuter plusieurs exemples à travers une gamme de conditions d'électroporation de sorte qu'une expérience peut être réalisée en même temps que l'optimisation est effectuée. Nous allons aussi montrer comment les conditions optimales identifiées en utilisant des plaques 96 puits électroporation peut être utilisé avec des cuvettes d'électroporation standard, facilitant le passage de plaques électroporation pour cuvettes d'électroporation tout en conservant l'efficacité d'électroporation mêmes. Dans la vidéo, nous allons aussi discuter de certains des principaux facteurs qui peuvent conduire à la réussite ou l'échec des expériences d'électroporation.

Protocole

Préparation de la cellule 1)

1. Lors de l'utilisation des cellules adhérentes, il est nécessaire de trypsiniser et de recueillir les cellules avant l'électroporation.
2. Pour comparer la transfection parmi les quatre fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) les cultures, ce qui représente trois chiffres autre passage, effectuez les opérations suivantes sur chaque flacon.
3. Aspirer milieux de culture cellulaire.
4. Ajouter PBS à laver les cellules.
5. Retirer du PBS, ajouter la trypsine suffisant pour couvrir les cellules, et d'attendre quelques minutes pour permettre à la trypsine pour détacher les cellules.
6. Vérifiez flacons avec un microscope afin de vérifier l'état des cellules, au beau flacon pour détacher les cellules, puis vérifiez à nouveau flacon pour fabriquer des cellules que sont tous détachés.
7. Temps d'attente supplémentaires et répéter si nécessaire.
8. Une fois que toutes les cellules sont détachées, ajouter de sérum contenant des médias pour neutraliser la trypsine.
9. Transfert des cellules dans un tube de centrifugeuse, et les cellules par centrifugation (RCF = 300 xg).
10. Retirer les cellules surnageant et remettre dans un volume connu de PBS.
11. Compter les cellules.
12. Transfert à un nouveau tube le volume approprié de suspension cellulaire de fournir le nombre requis de cellules pour des expériences (vous aurez besoin de 150 ul de cellules par puits à une densité de 1 x 10 ⁶ cellules / ml).
13. Centrifuger les cellules.
14. Retirer les cellules surnageant et remettre dans le volume approprié de tampon Gene Pulser électroporation pour atteindre une densité cellulaire de 1 x 10 ⁶ cellules / ml.
15. Ajouter 20 pg de plasmide par ml de suspension cellulaire et mélanger doucement.

2) l'installation cuve d'électroporation et l'électroporation

Configuration de la plaque et l'électroporation

1. Chambre de la plaque Branchez le module d'alimentation du système d'électroporation Gene Pulser MXcell.
2. Pipeter 150 uL mélange de cellules ou de tampon dans le puits d'une plaque de 96 puits électroporation.
3. Mettez la plaque dans la chambre de la plaque et le pouls.
4. Retirer la plaque de la chambre.
5. Mélanger le contenu bien par aspiration et refoulement dans chaque puits.
6. Transférer les cellules de chaque puits de pré-chauffée tampon en plaques de 12 puits.
7. Tap plaque à distribuer des cellules et le mettre dans l'incubateur.
8. Laissez les cellules récupérer pendant 24 heures.

Configuration Cuvette et l'électroporation

9. Débranchez chambre de la plaque du module de puissance du système d'électroporation Gene Pulser MXcell et de brancher le ShockPod ™ cuvette de chambre.
10. Pipeter 600 pi de suspension cellulaire dans une cuvette d'électroporation de 0,4 cm fossé.
11. Mettez la cuvette dans la chambre ShockPod et livrer impulsion électrique.
12. Retirer la cuvette de la chambre.
13. Mélanger le contenu cuvette par pipetage de haut en bas dans la cuvette.
14. Transférer les cellules de chaque puits de pré-chauffée tampon en plaques de 12 puits.
15. Tap plaque à distribuer des cellules et le mettre dans l'incubateur.
16. Laissez les cellules récupérer pendant 24 heures.

Résultats Représentant 3)

Après la transfection de cellules et de leur permettre de récupérer, d'analyser l'efficacité de transfection qualitativement, en utilisant la microscopie à épifluorescence, et quantitativement, en utilisant la cytométrie de flux.

Cellules Figure 1. Qui ont été avec succès et sont maintenant électroporées exprimant le gène de la GFP en microscopie à épifluorescence apparaissent.

Figure 2. Affichage des cellules sous contraste de phase permet la visualisation des cellules transfectées et non transfectées fois. Ce sont les cellules qui ont été exposés à l'impulsion de tension au plus bas électroporation 200V. Les cellules confluentes sont largement due à la haute densité cellulaire.

Figure 3. Le même champ de vue sous épifluorescence montre un certain nombre de cellules exprimant le marqueur sont GFP, mais ils sont seulement un petit pourcentage de cellules visibles dans l'image précédente.

Figure 4. A 250V, le nombre total de cellules vivantes vu sous contraste de phase diminue légèrement.

Figure 5. Sous épifluorescence, on peut voir que le nombre de cellules GFP exprimant a augmenté.

Figure 6. Au plus haut voltage appliqué, 375V, il ya moins de cellules vivantes visibles.

Figure 7. Toutefois, un pourcentage important des cellules restantes sont exprimant la GFP. Quelle condition est optimale dépend de la conception expérimentale. Dans certaines expériences le plus grand nombre de cellules transfectées pourrait être optimale, dans d'autres expériences de transfection pourcentage le plus élevé pourrait être meilleure.

Nous sommes intéressés par le pourcentage de cellules GFP-positives qui sont dans chaque condition et comment les pourcentages varient selon l'âge des cellules. La cytométrie en flux peuvent fournir des informations quantitatives sur les résultats de transfection sous chacune des conditions d'électroporation différents.

Figure 8. Voici le pourcentage de cellules GFP-positives qui sont dans le passage 5 cellules dans chacune des 12 conditions d'électroporation sont affichés. Le pourcentage de transfection maximale était d'environ 80% sous l'impulsion de la carie tension la plus élevée exponentielle, la condition 6, et 70% sous l'onde de pouls la plus forte testée carrés, l'état 12.

Figure 9. Avec les cellules passé 9 fois avant l'électroporation, le schéma global de pourcentage de transfection est presque identique, mais avec une très légère diminution dans les pourcentages de transfection.

Figure 10. Montré ici sont les pourcentages de cellules GFP dans le passage 13 cellules qui montrent une nette diminution en pourcentage par rapport à la transfection des cellules jeunes. Les pourcentages plus élevés de transfection ont été environ la moitié ce qui fut réalisé avec les cellules les plus jeunes démontrant l'importance d'utiliser des cellules saines dès que possible après l'isolement que possible.

Conditions d'électroporation utilisé pour les cellules MEF transfection utilisant le Gene Pulser MXcell
Condition (1-6) Impulsions de décroissance exponentielle, le tout avec 350 uF et 1000ohm	Tension (V)
1	200
2	250
3	300
4	326
5	350
6	376
Condition (7-12) Impulsions d'ondes carrées, le tout avec 2000 uF, 1000 ohms, et une impulsion	Tension (V)	Durée d'impulsion (ms)
7	200	10
8	250	10
9	300	10
10	200	20
11	250	20
12	300	20

Discussion

Cet article vidéo montre comment utiliser le système d'électroporation MXcell d'identifier facilement les conditions optimales pour l'électroporation FAE ou d'autres lignées de cellules primaires. Le format de plaque de 96 puits permet de nombreuses répliques de l'optimisation des conditions expérimentales ou à être effectuées simultanément, ce qui peut éliminer le besoin pour de nombreuses expériences distinctes. En effectuant cette procédure, il convient de rappeler d'utiliser des cellules saines dès que possible après l'isolement et à l'utilisation conditions d'électroporation qui sont appariés à la mémoire tampon d'électroporation.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Pulser® Electroporation Buffer	Bio-Rad	165-2676
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System	Bio-Rad	165-2670
Gene Pulser MXcell™ ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2673
Gene Pulser MXcell™ Electroporation System With ShockPod™ Cuvette Chamber	Bio-Rad	165-2674