الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

Summary

يصف هذا الإجراء وسيلة لعزل والثقافة الجهاز الفئران كورتي مع أو بدون حوف ودوامة لولبية العقدة العصبية. نظهر أيضا طريقة للتعبير عن الجينات مراسل الخارجية في جهاز ازدراع كورتي بواسطة electroporation.

Abstract

في جميع الثدييات ، ويقع ظهارة حسية عن الاختبار على طول الجهاز المتصاعد كورتي التي تتواجد داخل القوقعة في شكل محارة الأذن الداخلية (أنظر الشكل 1). يتم محاذاة خلايا الشعر في القوقعة النامية ، والتي هي الخلايا mechanosensory النظام السمعي ، في صف واحد من خلايا الشعر الداخلي وثلاثة (في منتصف القاعدة ويتحول) إلى أربعة (في مطلع القمي) صفوف من خلايا الشعر الخارجي التي تمتد على طول جهاز كورتي. خلايا الشعر تنبيغ الصوت الناجم عن الاهتزازات الميكانيكية في الغشاء القاعدي في النبضات العصبية التي يمكن للدماغ تفسيرها. هي سبب معظم حالات فقدان السمع الحسي عليها بالإعدام أو خلل في خلايا الشعر القوقعة.

أداة أساسية على نحو متزايد في مجال البحوث السمعي هو العزلة والثقافة في المختبر لازدراع الجهاز ^1،2،9 مرة واحدة معزولة ، يمكن الاستفادة من explants في عدة طرق لتوفير المعلومات المتعلقة المعيارية ، شاذة ، أو علم وظائف الأعضاء العلاجية. التعبير الجيني ، حركية أهداب ساكنة ، الخلية والبيولوجيا الجزيئية ، وكذلك النهج البيولوجية لتجديد خلايا الشعر هي أمثلة على التطبيقات التجريبية للجهاز explants كورتي.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لعزل وثقافة جهاز كورتي من الفئران حديثي الولادة. شريط الفيديو المرافق تشمل الاتجاهات متدرج للعزلة العظم الصدغي من الجراء الماوس ، والعزلة لاحقة من القوقعة ، الرباط لولبية ، وجهاز كورتي. مرة واحدة معزولة ، ويمكن مطلي ظهارة حسية وتربيتها في المختبر في مجمله ، أو في شكل تشريح أخرى. عزل الصغيرة التي تفتقر إلى حوف ودوامة لولبية العقدة العصبية باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحفاظ على explants الأولية لمدة 7-10 أيام. كمثال على فائدة هذا الإجراء ، سيتم electroporated جهاز explants كورتي مع الجين مراسل DsRed الخارجية. هذا الأسلوب يوفر تحسنا اكثر من غيرها من أساليب المنشورة لأنها توفر توجيهات يمكن استنساخه ، لا لبس فيها ، ومتدرج للعزلة ، microdissection والثقافة الأساسي للجهاز كورتي.

Protocol

اليوم 1. التعقيم وطلاء الزجاج coverslips.

1. تعقيم جاف coverslips ميكروسكوب في الأوتوكلاف.
2. ضع coverslips تعقيمها في بئرين من قبل تعقيمها جيدا أربعة خلية طبق الثقافة.
3. معطف مع coverslips 01:01 بولي - L - الأورنيثين laminin وتستكمل مع مصل بقري جنيني من 20 ٪ (FBS) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   1. 400 ميكرولتر بولي - L - الأورنيثين (محلول 0.01 ٪ المخزنة في 4 درجات مئوية)
   2. 400 laminin ميكرولتر (50 ميكروغرام / مل محلول المخزون المخزنة في aliquots في -20 درجة مئوية)
   3. 200 ميكرولتر FBS (المخزنة في aliquots في -20 درجة مئوية)
4. حرارة تعقيم الأدوات تشريح بين عشية وضحاها في حاضنة 150 درجة مئوية.
5. جعل مستنبت يحتوي على مصل الدم 10 ٪ و 10 الأمبيسيلين ملغ / مل.
   1. 90 مل Dulbecco في التعديل النسر متوسطة
   2. 5 مل FBS (المخزنة في aliquots في -20 درجة مئوية)
   3. 5 مل مصل الحصان (المخزنة في aliquots في -20 درجة مئوية)
   4. الأمبيسيلين 10 ميكرولتر (10 ملغ / مل حل الأسهم المخزنة في 4 درجات مئوية)

اليوم 2. بمعزل عن جهاز كورتي.

1. تعقيم تشريح تدفق إيجابي غطاء محرك السيارة.
   1. بدوره على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة
   2. رش جميع الأسطح مع الايثانول 70 ٪ وانتظر 5 دقائق قبل الاستخدام.
2. قطع رأس الفأر الجرو (P4) في قاعدة ماغنوم الثقبة باستخدام مقص التشغيل.
3. شطف لفترة وجيزة في الرأس في صحن 10 سم تحتوي على الايثانول 70 ٪.
4. إزالة البشرة باستخدام شفرة المشرط.
5. فتح الجمجمة على طول الدرز السهمي باستخدام شفرة المشرط ومن ثم تقسم على الدماغ المقدم. الإبقاء على الدماغ المقدم عجزي عن المزيد من التشريح.
6. إزالة الدماغ الأمامي ، والمخيخ وجذع الدماغ باستخدام تشريح حادة.
7. إزالة العظام الزمنية (الشكل 2A) ، وتراجع لفترة وجيزة في الإيثانول منهم 70 ٪ ، ونقلها إلى طبق 3 ملم تحتوي على HBSS العقيمة.
8. باستخدام ملقط ، إزالة الفقاعة والأنسجة المحيطة بها من الجزء الصخري للعظم الصدغي.
9. تحديد شكل محارة القوقعة (الشكل 2B) وفصلها عن النظام الدهليزي باستخدام ملقط.
10. في هذه المرحلة من التنمية ، وليس متاهة العظمية متكلسة تماما ويتم تشريح بسهولة باستخدام ملقط. إزالة التيه العظمي من القوقعة التي فصل دقيق ابتداء من نهاية القاعدية وتتحرك apically باستخدام ملقط.
11. وملفوف في الرباط الحلزوني وجهاز المرفقة كورتي على طول اللولب عماد القوقعة (الشكل 2C). إزالة بعناية جهاز كورتي من خلال تأمين في الرباط الحلزوني في المنطقة هوك في قاعدة الفك باستخدام ملقط وأنها تقوم بنقل apically.
12. ابتداء من القاعدة ، وإزالة الرباط دوامة من جهاز كورتي باستخدام الملقط غرامة # 55 (الشكل 2D).
    الجزئي بمعزل عن جهاز كورتي ظهارة حسية (اختياري).
13. إزالة الجهاز من منطقة كورتي هوك في قاعدة باستخدام اثنين مع 28G U - 100 يعلق بشكل دائم ½ الإبر والمحاقن ملقط الأنسولين ½ سم.
14. بدءا من قمة ، وإزالة الحوف دوامة من صف من خلايا الشعر الداخلي والمضي قدما basally (التين 2E - F).
    طلي الجهاز من يزدرع كورتي
15. إزالة الحل poly-L-ornithine/laminin/FBS من الآبار والثقافة ، وإضافة 130 ميكرولتر من المتوسط ​​الثقافة.
16. نقل الجهاز تشريح كورتي إلى ساترة الزجاج المطلي في الثقافة بشكل جيد وتوجيه يزدرع بحيث أهداب من خلايا الشعر إلى الارتفاع.
17. إزالة المتوسطة في الثقافة جيدا باستخدام ماصة 200 ميكرولتر. تأكد من أن الغشاء القاعدي يجعل الاتصال متينة مع ساترة الزجاج المطلي.
18. إضافة بعناية 130 ميكرولتر من مستنبت للجهاز كورتي باستخدام ماصة مل 200. تطبيق نقطتين على سطح الجهاز كورتي ثم إضافة ببطء حجم المتبقية إلى جانب ساترة. تأكد من أن جهاز كورتي لا تطفو في وسائل الإعلام والثقافة ، لكنها لا تزال الملصقة على ساترة.
19. يحضن بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في وجود 5 ٪ CO _2.

اليوم 3. Electroporation من الجينات في الجهاز الصحافي المثقف كورتي.

1. إزالة مستنبت من الجهاز للثقافة كورتي.
2. إضافة ميكرولتر 130 H ₂ O : 1 دقيقة ثم إزالة باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
3. إضافة 30 ميكرولتر من مراسل DsRed البلازميد (2mg / مل H ₂ O المخزنة في -20 درجة مئوية).
4. تقدم الأقطاب من electroporator باستخدام micromanipulator بحيث الأنود aالثانية هي الكاثود على جانبي الثقافة.
5. توليد نبضة (27V ، و 30 مللي ثانية مدتها 10 نبضة القطارات) لمراسل electroporate الجين في الجهاز الثقافة يزدرع كورتي.
   1. اختياري : عكس القطبية للنبض لضمان electroporation من التحوير على modiolar كلا الجانبين والرباط دوامة من ازدراع.
6. انتظر 5 دقائق.
7. إضافة 130 ميكرولتر من Fugene 6 : حل الحمض النووي (3 أجزاء الحمض النووي للأجزاء Fugene 2). وينبغي إعداد هذا الحل قبل بدء الإجراء electroporation (الخطوة 20) باستخدام جولة 3 مل أسفل البوليسترين في أنبوب اختبار تدفق الصفحي هود. لجعل هذا الحل :
   1. إضافة 2.4 ميكرولتر من OPTI - MEM (المخزنة في 4 درجات مئوية) في أنبوب اختبار.
   2. إضافة 0.6 ميكرولتر من 6 كاشف Fugene (المخزنة في 4 درجات مئوية) في أنبوب اختبار. تأكد من إضافة Fugene مباشرة إلى OPTI - MEM وتجنب الاتصال المباشر مع الجانبين للأنبوب اختبار.
   3. دوامة لمدة 1 ثانية.
   4. احتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   5. إضافة 2.0 ميكرولتر مراسل البلازميد DsRed مضاعفة الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل (المخزنة في -20 درجة مئوية في الحمض النووي ميكروغرام / 100 مل aliquots H ₂ O).
   6. دوامة لمدة 1 ثانية.
   7. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   8. إضافة 200 ميليلتر من مستنبت.
   9. دوامة لمدة 1 ثانية.
8. يحضن بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في ثاني 5 ٪ _2.
9. إضافة 2 مل مستنبت للثقافة بشكل جيد واحتضان لمدة 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 يوما.

ممثل النتائج

نقدم طريقة لعزل الجهاز كورتي من ماوس حول الولادة. ويمكن استخدام هذا الإجراء بالنسبة للفئران لم يتجاوزن اليوم الجنينية تصل إلى حوالي 16 يوما بعد الولادة 6 ، وعند هذه النقطة يصبح متكلسة بصورة كافية لجعل التيه العظمي تشريح مرهقة. مرة واحدة يتم تشريح الجهاز كورتي ، قد يكون مطلي انه مثقف وإما في مجملها (الشكل 3) أو الجزئي معزولة ظهارة حسية (التين 4). قدمنا ​​كذلك تقنية للتعبير جينات دخيلة في جهاز مثقف كورتي. ثقافة عضوي النمط مفيد لأنواع أخرى عديدة من الدراسة ، مثل جهاز تحليل التعبير الجيني كورتي باستخدام RT - PCR أو التهجين في الموقع ، جهاز كورتي شارك في الثقافة مع خلايا العقدة الحلزونية أو الخلايا الجذعية الخارجية باستخدام عزل متناهية الصغر ³ ، أو في التحليل المختبري من موت الخلايا الشعر والتجدد.

الشكل 1. المقطع العرضي للجهاز P4 الفئران كورتي. (أ) من المقطع العرضي بدوره القاعدية من القوقعة cryosectioned تم الحصول عليها من ماوس P4 يوضح الهياكل العامة للالقوقعة الفئران الموصوفة في هذا البروتوكول. يحدها من قبل وسائل الإعلام سكالا في الرباط الحلزوني وعائي السطور أفقيا ، وغشاء Reissner ق متفوق ، وحوف دوامة بشكل إعلامي ، والغشاء القاعدي دون المستوى. وأشار مربع في المنطقة الموسعة في باء (B) ويقع الجهاز كورتي على الجانب العلوي للغشاء القاعدي ، ويشمل صف واحد من خلايا الشعر الداخلية ، ثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجي ، ودعم كل منها الخلايا. 1 يشير إلى خط متقطع الموقع على طول الغشاء القاعدي أن تتم إزالة هذا الجهاز خلال التشريح كورتي. 2 خط متقطع يشير الموقع على طول الغشاء القاعدي أن تتم إزالة أثناء إجراء الدقيقة العزلة. تشير العلامات الخضراء المناعى من calbindin ، التي تصف الخلايا بين الأسنان من دوامة حوف ، وخلايا شعر القوقعة ، العقدة العصبية لولبية ، وكذلك الخلايا في الرباط الحلزوني وعائي السطر ^7. دابي وسم نوى في الزرقاء.

الشكل 2. تشريح جهاز كورتي. صور من شريط الفيديو المرافق للجهاز من تسليط الضوء على تشريح كورتي أ) النظام الدهليزي القوقعة والتي تقع داخل العظم الصدغي معزولة (الحمراء) ، B) في متاهة من القوقعة العظمية ، C) في الرباط ودوامة المرفقة جهاز كورتي بعد إزالة المتاهة العظمية ، D) إزالة الرباط الحلزوني وعائي السطر (أحمر) من جهاز كورتي ، E) الصغيرة عزلة ظهارة حسية من دوامة حوف (الحمراء) ، وواو) معزولة دوامة حوف (يسار) وظهارة حسية (يمين).

الشكل 3. عضو مثقف من يزدرع كورتي. صورة تظهر مدينة دبي للإنترنت من الجهازكورتي للماوس Atoh1 - P4 nGFP التي كانت معزولة ، مطلي ، وتربيتها لمدة خمسة أيام كما هو موضح. وقد تم هذا الفأر وراثيا بحيث الخلايا التي تعبر عن الجين الخلايا الموالية للشعر واهن homolog 1 (الملقب Atoh1 Math1) يحمل بروتين الفلورية الخضراء التي يتم المترجمة إلى النواة ^8. أجهزة كورتي من هذه الفئران يحمل تسمية GFP النووي في نواة الخلية كل الشعر ، وبالتالي السماح لرؤية سهلة للظهارة حسية باستخدام المجهر epifluorescent. ويمكن أن ينظر إلى دوامة كبيرة نسبيا حوف الوحشي للظهارة حسية. خلايا اللحمة المتوسطة هاجروا التي نشأت من جهاز كورتي بعيدا عن ازدراع. التسمية النووية الأزرق دابي.

الشكل 4. الصغيرة المعزولة ظهارة حسية. Epifluorescent صورة تم الحصول عليها من ظهارة حسية الذي تم عزله من الجهاز P4 الفئران كورتي كما هو موضح والمثقف بين عشية وضحاها. تم إصلاح ثم عزل في الدقيقة بارافورمالدهيد 4 ٪ ومعالجتها للimmunolabeling 7A من الميوسين الذي تسميات خلايا الشعر القوقعة. لاحظ غياب حوف دوامة أكبر نسبيا من الرقم 3. التسمية النووية الأزرق دابي.

الشكل 5. Electroporation من الجينات مراسل DsRed في الجهاز مثقف كورتي. عزلت أجهزة الجامعة كورتي من الجراء P4 الماوس Atoh1 - nGFP ، مطلي ، وelectroporated ثم مع الجين مراسل DsRed كما هو موضح ومن ثم ينظر تحت المجهر epifluorescent. خلايا جهاز كورتي يزدرع أن أعرب عن البروتينات المعدلة وراثيا مراسل DsRed يحمل خلايا الدم الحمراء ومضان الذاتية للمعرض ظهارة حسية ومضان أخضر النووية. ويمكن رؤية الخلايا المعدلة وراثيا في جميع أنحاء حوف دوامة وظهارة حسية.

Discussion

هناك العديد من التفاصيل التي تعتبر حاسمة بالنسبة لنجاح هذا الإجراء. وأقصر وقت من العزلة العظم الصدغي للجهاز حضانة كورتي ، زادت فرصة أن الأجهزة سوف نعلق على ساترة ، ويؤدي في الثقافات الجهاز قابلة للحياة. لذا ، فمن المهم للحد من مقدار الوقت بين التشريح ووضع الأجهزة في الحاضنة. اختيار المضادات الحيوية أمر حاسم أيضا ، لأن المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد كثيرة السامة ، وسوف يؤدي إلى موت الخلايا الشعر. على الرغم من أنه من الأفضل التخلي عن استخدام المضادات الحيوية تماما ، وهذا يترك الباب مفتوحا أمام إمكانية للتلوث. لذا ، نقترح استخدام 10 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين كقاعدة عامة للتغلب على مشاكل التلوث المحتملة.

الجانب الأكثر إزعاجا من ذلك ، وغيرها من الإجراءات لثقافة الرئيسي للهيئة في كورتي ، والميل للأجهزة لتطفو قبالة لوحات أثناء الحضانة. على الرغم من الثقافات الجهاز عائمة يمكن أن تبقى صالحة لمدة 5-7 أيام ، وهناك عيوب أجهزة زراعة العائمة. على سبيل المثال ، والثقافات الجهاز العائمة أضعاف في كثير من الأحيان على أنفسهم بعد 4-5 أيام تقديم المجهري للمشاكل. بعد ذلك ، يمكن أن تصبح خطر على السلامة الهيكلية للجهاز بالمقارنة مع الأجهزة التي تم اضافته الى ساترة. لقد وجدنا أن تساعد الطرق التالية للتأكد من أن جهاز كورتي لا تطفو في وسائل الإعلام والثقافة ، لكنها لا تزال الملصقة على ساترة. أولا ، ومعطف الزجاج coverslips في polyornithine 1:1 / laminin تستكمل مع FBS 20 ٪ كما هو موضح. وبين عشية وضحاها حضانة دعا في هذا البروتوكول هو الحد الأدنى من الوقت الذي يجب أن تطلى اللوحة. في المختبر لدينا ، فإننا كثيرا ما معطف جميع لوحات أننا في حاجة لمدة اسبوع والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية حتى قبل يوم ونحن لاستخدامه عند نقلها إلى حاضنة لتفريخ بين عشية وضحاها. الثانية ، بعد أن يتم نقلها إلى أجهزة coverslips المغلفة ، وتوجيه يزدرع بحيث أهداب من خلايا الشعر مواجهة. وهذا التوجه تسهيل انضمام الغشاء القاعدي للصحن الثقافة. ثالثا ، إزالة وسائل الإعلام داخل البئر ليضعوا على لازدراع الطبق المطلي. وهذا ضمان الاتصال بين الطبق والثقافة ، والغشاء القاعدي وتعزيز قدرة explants التمسك الزجاج. هذا سوف يساعد أيضا في الحفاظ على السلامة الهيكلية للصفوف من خلايا الشعر. أخيرا ، بالتنقيط بعناية 2 قطرات من الثقافة المتوسطة على سطح الجهاز كورتي باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ثم ملء ببطء البئر بواسطة نازف حجم المتبقية (من مجموع 130 ميكرولتر) على جانب من ساترة. من المهم أن نعمل بسرعة لضمان الحجز على الجهاز كورتي إلى ساترة المغلفة. من الشروع في تشريح لحضانة explants ، فإنه عادة ما يستغرق 10 دقائق لمشغل يمارس لإكمال هذا الجهاز الداخلي العزلة كورتي.

في هذا البروتوكول ، نقدم أيضا وسيلة لعزل الجزئي للظهارة حسية من حوف دوامة جهاز كورتي. في هذا الإجراء ، يتم تشريح حوف دوامة بعيدا عن ظهارة حسية باستخدام إبر الأنسولين 28G ½ كأدوات تشريح. ويتكون الناتج الدقيقة عزل للصفوف من خلايا الشعر ويناظرها الخلايا الداعمة (الشكل 3). ويمكن عندئذ للظهارة حسية تكون معزولة مثقف كما هو موضح في هذا البروتوكول. وينبغي مقارنة هذا الإجراء العزل الجزئي للفصل الأنزيمية للظهائر الحسية من الأنسجة المحيطة ^4. في الثدييات ، فضلا عن الأنواع غير الثدييات مثل الدجاج ، والهضم thermolysin معزولة النتائج الأجهزة الدهليزي في عزلة ظهائر الحسية من خلايا اللحمة المتوسطة قبو ^4. في القوقعة الفئران ، ونتائج عملية الهضم thermolysin في فصل الحرف أكبر الظهارية ، والحرف أقل الظهارية ظهائر الحسية المصاحبة من الغشاء القاعدي ^5. ومع ذلك ، فإنه من غير الواضح ما إذا كانت قوقعة ظهارة حسية يمكن أن نعلق على لوحات مغلفة دون خلايا اللحمة المتوسطة المصاحبة. في حين أن كلا الميكانيكية الدقيقة العزلة الأسلوب والطريقة الأنزيمية نتيجة الهضم في فصل ظهائر الحسية من دوامة حوف ، مزايا التشريح الدقيقة عزل على الهضم thermolysin تشمل بروتوكول أقصر نسبيا ، وأرخص المواد الكاشفة ، والتوتر المحتمل أن تكون أقل ونتيجة للتأثيرات يزدرع الأنزيمية للهضم. بالإضافة إلى ذلك ، يتم ترك سليمة الغشاء القاعدي في هذا النهج ، الذي قد يؤدي إلى تعزيز مرفق للظهارة حسية إلى لوحة الثقافة. مساوئ هذا الأسلوب تشمل الحاجة لتطوير المهارات اللازمة لهذا التشريح الدقيق والأضرار الميكانيكية المحتملة للظهارة حسية الناتجة عن التشريح الجزئي.

كمثال على فائدة هذا الإجراء ، ونحن أيضا تقديم مثال واحد على استخدام جهازكورتي الثقافات ، وelectroporation جينات دخيلة في ثقافة ازدراع. ويستند هذا الإجراء electroporation المذكورة أعلاه على الطرق السابقة من جهاز electroporation كورتي. على وجه الخصوص ، وتشنغ قاو (2000) وصفا لelectroporation الأجهزة الفئران المعزولة كورتي حيث يحتجز في مكان لexplants electroporation بواسطة أخدود مصبوب من agarose ومطلي ثم على الكولاجين المغلفة الشريحة LabTek 8 جيدا في المصل خالية المتوسطة ^2. ميزة هذا النهج هو أنه موجهة الأجهزة بحيث السطوح أعلى explants مواجهة القطب السالب ، والتي ينبغي أن يؤدي نظريا في التوزيع حتى من الخلايا electroporated عبر ازدراع. في أيدينا إلا أن الطريقة التي وصفنا تحسن على هذا الإجراء لأن الجهاز كورتي بقيت الملصقة على ساترة في جميع أنحاء الداخلي مما يحد من التلاعب في يزدرع بعد electroporation. بالإضافة إلى ذلك ، لا تزال تعلق نسبة أعلى من أجهزة كورتي إلى coverslips باستخدام هذه الطريقة المعروضة. يؤخذ من أسلوبنا جونز ، وآخرون (2006) والذي يستخدم إضافة كاشف 6 Fugene لزيادة كفاءة في التعبير الجيني بعد electroporation. في بروتوكول جونز وآخرون (2006) ، وelectroporated أجهزة والمحتضنة لمدة 5 دقائق مع 100 ميكرولتر من كاشف Fugene ترنسفكأيشن 6 ، و ⁶ مطلي. أسلوبنا يختلف في استخدام نسبة 3:02 من 6 كاشف Fugene لبلازميد الحمض النووي ، الذي وجدناه تجريبيا لتوفير وراثيا التعبير الأمثل مع سمية الجهاز الأدنى. نحن لا نستخدم مخفف Fugene 6 كاشف ، التي يمكن أن تؤدي إلى تسمم في الثقافات. التكوين الكهربائي في بروتوكول لدينا ، فضلا عن جونز وآخرون (2006) ، والنتائج الأولية في التعبير الجيني في دوامة إما حوف ظهارة حسية أو تبعا للموقف الكاثود. على الرغم من أن هناك خلايا DsRed ايجابية على الجانب من الثقافة بعيدة إلى القطب السالب ، وهناك تركيز أعلى من الخلايا المعدلة وراثيا أقرب إلى الكاثود. لضمان التعبير الكامل للالتحوير في كلا الجانبين من جهاز ازدراع كورتي ، يمكن عكس التيار لقطار نبضة الثانية يقود عكس ببساطة. النتائج الواردة في بروتوكول تعبير قوي من التحوير في جميع أنحاء جهاز كورتي (الشكل 5).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass microscope coverslips	DYNALAB Corporation	2010	10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce
4 ringed cell culture dish	Greiner Bio-One	627170	Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	0.01% Solution
Laminin	BD Biosciences	354232	made in mouse
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140-095	Qualified
Operating scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6806	Straight, sharp-blunt length 5"
#11 Scalpel Blade	BD Biosciences	372611
#4 Dumoxel forceps	Fine Science Tools	11241-30
#55 Dumostar fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Invitrogen	10564-011	High Glucose
Horse Serum	Invitrogen	2605088	Heat Inactivated
Ampicillin Sodium Salt	Invitrogen	11593-027	Irradiated
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe	BD Biosciences	329465	U-100 28G½
Fugene 6 Transfection Reagent	Roche Group	11-815-091-001
Polystyrene test tube	Fisher Scientific	14-956-5A
Laminar flow hood	The Baker Company (Stanford, ME)	Model SG603a	SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Invitrogen	31985
Reporter plasmid	Clontech Laboratories	632539	pCMV DsRed-Express 2
Electroporator	Bio-Rad	165–2662	BioRad Gene Pulser Xcell