Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

Resumen

Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.

Resumen

En todos los mamíferos, el epitelio sensorial de la audición se encuentra a lo largo del órgano espiral de Corti que se encuentra dentro de la cóclea en forma de caracol del oído interno (fig 1). Las células pilosas en la cóclea de desarrollo, que son las células mechanosensory del sistema auditivo, se alinean en una fila de células ciliadas internas y tres (en la base y la mitad de vueltas) a cuatro (en la vuelta apical) hileras de células ciliadas externas que abarcan todo el largo del órgano de Corti. Transducción de las células ciliadas de sonido inducida por las vibraciones mecánicas de la membrana basilar en impulsos nerviosos que el cerebro puede interpretar. La mayoría de los casos de pérdida auditiva neurosensorial son causados ​​por la muerte o la disfunción de las células pilosas cocleares.

Una herramienta cada vez más esencial en la investigación auditiva es el aislamiento y cultivo in vitro de los explantes de órganos ^1,2,9. Una vez aislados, los explantes se puede utilizar de varias maneras para proporcionar información sobre normativa, anómalo, o la fisiología terapéutica. La expresión génica, la motilidad estereocilios, biología celular y molecular, así como los enfoques biológicos para la regeneración de las células ciliadas son ejemplos de aplicaciones experimentales de órgano de Corti explantes.

Este protocolo describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti de ratones recién nacidos. El video que acompaña incluye instrucciones paso a paso para el aislamiento del hueso temporal de crías de ratón, y el posterior aislamiento de la cóclea, el ligamento espiral, y el órgano de Corti. Una vez aislado, el epitelio sensorial puede ser plateado y se cultivan in vitro en su totalidad, o como un micro-disección más aislado que carece de la espiral de limbo y de las neuronas del ganglio espiral. Usando este método, explantes primarios se puede mantener durante 7-10 días. Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, el órgano de Corti explantes se electroporated con un gen reportero DsRed exógenos. Este método proporciona una mejora sobre otros métodos publicados, ya que proporciona direcciones reproducible, sin ambigüedades, y paso a paso para el aislamiento, la microdisección, y la cultura principal del órgano de Corti.

Protocolo

Día 1. La esterilización y el recubrimiento de cubreobjetos de vidrio.

1. Seco esterilizar cubreobjetos de vidrio microscopio en un autoclave.
2. Coloque el cubreobjetos esterilizados en dos pocillos de una pre-esterilizados cuatro y placa de cultivo celular.
3. Cubra el cubreobjetos con 1:1 de poli-L-ornitina y laminina complementado con suero fetal bovino 20% (FBS) durante la noche a 4 ° C.
   1. 400 l de poli-L-ornitina (solución de 0,01% se almacenan a 4 ° C)
   2. 400 laminina l (50 mg / ml de solución de archivo almacenado en alícuotas a -20 ° C)
   3. FBS 200 l (almacenado en alícuotas a -20 ° C)
4. Calor a esterilizar los instrumentos de disección durante la noche en una incubadora de 150 ° C.
5. Hacer un medio de cultivo que contienen 10% de suero y 10 ampicilina mg / ml.
   1. 90 ml de Dulbecco Modificado Medio Eagle
   2. 5 ml de FBS (almacenado en alícuotas a -20 ° C)
   3. 5 ml de suero de caballo (almacenado en alícuotas a -20 ° C)
   4. 10 l ampicilina (10 mg / ml de solución de archivo se almacenan a 4 ° C)

Día 2. Aislamiento del órgano de Corti.

1. Esterilizar la campana de flujo positivo de disección.
   1. encender la luz UV durante 20 minutos
   2. pulverizar todas las superficies con un 70% de etanol y espere 5 minutos antes de su uso.
2. Decapitar a las crías de ratón (P4) en la base del agujero occipital con unas tijeras de operación.
3. Brevemente enjuague la cabeza en un plato de 10 cm que contiene 70% de etanol.
4. Eliminar la epidermis con un bisturí.
5. Abrir el cráneo a lo largo de la sutura sagital con un bisturí y luego dividir en dos el cerebro anterior. Mantener el cerebro anterior caudal de disección.
6. Quitar el cerebro anterior, cerebelo y tronco cerebral utilizando disección roma.
7. Quitar los huesos temporales (Fig. 2A), sumergirlos brevemente en etanol al 70%, y transferirlos a un plato de 3 mm que contiene HBSS estéril.
8. Con unas pinzas, retire la bulla y el tejido circundante de la porción petrosa del hueso temporal.
9. Localice la concha en forma de caracol (Fig. 2B) y separarla del sistema vestibular el uso de fórceps.
10. En esta etapa de desarrollo, el laberinto óseo no está completamente calcificado y es fácilmente disecados con las pinzas. Retire el laberinto óseo de la cóclea por la separación cuidadosa de partida en el extremo basal y apical en movimiento con unas pinzas.
11. El ligamento espiral y el órgano de Corti se adjunta en espiral a lo largo de la espiral del modiolo (Fig. 2C). Retire con cuidado el órgano de Corti, asegurando el ligamento espiral en la región del gancho de la base con las pinzas y relajarse como usted se mueve hacia apical.
12. A partir de la base, retire el ligamento espiral del órgano de Corti con # 55 pinzas finas (Fig. 2D).
    Micro-aislamiento del órgano de Corti del epitelio sensorial (Opcional).
13. Quitar el órgano de Corti región gancho de la base con dos jeringas ½ cc con insulina permanentemente conectado U-100 28G ½ agujas como los fórceps.
14. Comenzando desde el ápice, eliminar el limbo espiral de la fila de las células ciliadas internas y proceder basales (Fig. 2E-F).
    Revestimiento del órgano de Corti explante
15. Eliminar la solución poly-L-ornithine/laminin/FBS de los pozos de la cultura y añadir 130 l de medio de cultivo.
16. Transferir el órgano de Corti diseccionado a la cubreobjetos de vidrio revestidas de la cultura y el explante y orientar de manera que los cilios de las células ciliadas están apuntando hacia arriba.
17. Eliminar el medio de la cultura y con una pipeta de 200 mL. Asegúrese de que la membrana basilar se pone en contacto sólido con el cubreobjetos recubiertos.
18. Añadir con cuidado 130 l de medio de cultivo para el órgano de Corti con una pipeta 200 ml. Aplicar dos gotas en la superficie del órgano de Corti y luego agregue lentamente el volumen restante a un lado del cubreobjetos. Asegúrese de que el órgano de Corti no flota en el medio de cultivo, pero sigue siendo colocada en el cubreobjetos.
19. Incubar toda la noche a 37 ° C en presencia de 5% de CO _2.

Día 3. Electroporación del gen reportero en cultivos de órganos de Corti.

1. Retire el medio de cultivo del órgano de Corti cultura.
2. Añadir 130 l H ₂ O durante 1 minuto y luego retirar con una pipeta de 200 mL.
3. Añadir 30 l de plásmido reportero DsRed (2 mg / mL H ₂ O almacenadas a -20 ° C).
4. Avance de los electrodos de la electroporador utilizando un micromanipulador para que el ánodo de unacátodo º están a ambos lados de la cultura.
5. Generar un pulso (27V, 30 ms de duración, 10 trenes de pulsos) para electroporar el gen reportero en el órgano de Corti explante cultura.
   1. Opcional: invertir la polaridad del pulso para asegurar la electroporación de los transgenes en los dos lados y el modiolar espiral ligamento del explante.
6. Esperar 5 min.
7. Añadir 130 l de la Fugene 6: La solución de ADN (3 partes Fugene a 2 partes de ADN). Esta solución debe prepararse antes del inicio del procedimiento de electroporación (paso 20) con una ronda de 3 ml de fondo de poliestireno tubo de ensayo en una campana de flujo laminar. Para preparar esta solución:
   1. Añadir 2,4 l de Opti-MEM (almacenadas a 4 ° C) al tubo de ensayo.
   2. Añadir 0,6 l de Fugene 6 reactivo (almacenado a 4 ° C) al tubo de ensayo. Asegúrese de añadir la Fugene directamente a la Opti-MEM y evitar el contacto directo con los lados del tubo de ensayo.
   3. Vortex durante 1 segundo.
   4. Incubar 5 min a temperatura ambiente.
   5. Añadir 2,0 l periodista DsRed plásmido ADN de doble cadena (almacenadas a -20 ° C a 100 ug de ADN / mL H ₂ O alícuotas).
   6. Vortex durante 1 segundo.
   7. Incubar 15 min a temperatura ambiente.
   8. Añadir 200 l de medio de cultivo.
   9. Vortex durante 1 segundo.
8. Incubar toda la noche a 37 ° C en 5% de CO _2.
9. Añadir 2 ml de medio de cultivo a la cultura e incube a 37 ° C durante un máximo de 10 días.

Resultados representante

Se presenta un método para el aislamiento del órgano de Corti de un ratón perinatal. El procedimiento se puede utilizar para los ratones de tan sólo el día embrionario 16 hasta aproximadamente el día postnatal 6, momento en el que el laberinto óseo se vuelve lo suficientemente calcificados para hacer la disección engorroso. Una vez que el órgano de Corti es disecado, puede ser plateado y cultivadas, ya sea en su totalidad (Fig. 3) o como micro-aislados epitelio sensorial (Fig. 4). Además, hemos presentado una técnica para expresar genes exógenos en el órgano de Corti cultivadas. El cultivo organotípico es útil para muchos otros tipos de estudio, tales como el análisis del órgano de Corti expresión génica mediante RT-PCR o hibridación in situ, el órgano de Corti co-cultivo con células del ganglio espiral o células madre exógenas con el aislamiento de micro- ^3, o en análisis in vitro de la muerte celular y la regeneración del cabello.

Figura 1. Sección transversal del órgano de Corti P4 murino. (A) Una sección transversal de la vuelta basal de la cóclea cryosectioned obtenido de un ratón P4 ilustra las estructuras generales de la cóclea murino se describe en este protocolo. La escala media está bordeado por el ligamento espiral y la estría vascular lateralmente, la membrana de Reissner s superior, la espiral limbo medial, y la membrana basilar hacia abajo. La caja indica la región se expandió en B. (B) El órgano de Corti se encuentra en la parte superior de la membrana basilar, e incluye una hilera de células ciliadas internas, tres hileras de células ciliadas externas, y sus respectivas celdas de apoyo. Una línea de puntos indica la localización a lo largo de la membrana basilar que se elimina durante este órgano de la disección de Corti. La línea de puntos 2 indica la ubicación a lo largo de la membrana basilar que se elimina durante el proceso de micro-aislamiento. El color verde indica marcaje inmunohistoquímico de calbindina, que las etiquetas de las células interdentales del limbo espiral, las células cocleares del cabello, las neuronas del ganglio espiral, así como las células del ligamento espiral y vascular ⁷ estría. DAPI etiquetado de los núcleos en azul.

Figura 2. Órgano de Corti disección. Las imágenes del vídeo de acompañamiento del órgano de Corti destacar la disección A) el sistema vestibular y la cóclea situada dentro del hueso temporal aislados (rojo), B) el laberinto óseo de la cóclea, C) el ligamento espiral y unida órgano de Corti después de la eliminación del laberinto óseo, D) la eliminación del ligamento espiral y la estría vascular (rojo) del órgano de Corti, E) micro-aislamiento del epitelio sensorial del limbo espiral (color rojo), y la F) aislados limbo espiral (izquierda) y el epitelio sensorial (derecha).

Figura 3. Órgano de Corti explante cultivados. DIC imagen que muestra el órgano deCorti de un P4 Atoh1-nGFP ratón que fue aislado, plateado, y se cultivaron durante cinco días, tal como se describe. Este ratón ha sido genéticamente modificados para que las células que expresan el gen de las células pro-pelo atonal homólogo 1 (aka Atoh1 Math1) presentan una proteína verde fluorescente que se localiza en el núcleo ^8. Los órganos de Corti de estos ratones presentan una etiqueta GFP nuclear en todos los núcleos de las células del pelo y por lo tanto, permiten una fácil visualización del epitelio sensorial mediante un microscopio de epifluorescencia. La espiral relativamente grande limbo puede ser visto por fuera del epitelio sensorial. Las células mesenquimales que tienen su origen en el órgano de Corti han emigrado fuera del explante. Etiqueta azul es nuclear DAPI.

Figura 4. Micro-aislados epitelio sensorial. Epifluorescencia la imagen obtenida del epitelio sensorial que se ha aislado de un órgano de Corti P4 murino como se describe y se cultivan durante la noche. El micro-aislamiento se fija entonces en paraformaldehído al 4% y se procesaron para inmunomarcación de 7a miosina que las etiquetas de las células cocleares del cabello. Nótese la ausencia de la espiral comparativamente mayor limbo de la figura 3. Etiqueta azul es nuclear DAPI.

Figura 5. Electroporación del gen reportero DsRed en el órgano de Corti cultivadas. Órganos enteros de Corti de P4 Atoh1-nGFP crías de ratón fueron aisladas, plateado, y luego electroporated con el gen reportero DsRed como se describe y luego se observan bajo un microscopio de epifluorescencia. Las células del órgano de Corti explante que expresa la proteína transgénica reportero DsRed células presentan una fluorescencia roja y endógenos de la exposición del epitelio sensorial una fluorescencia verde nuclear. Células transgénicas se pueden ver en el limbo espiral y el epitelio sensorial.

Discusión

Hay varios detalles que son fundamentales para el éxito de este procedimiento. Cuanto más corto sea el tiempo de aislamiento de los temporales de órgano de Corti de incubación, mayor será la posibilidad de que los órganos se conectará con el cubreobjetos y el resultado en cultivos de órganos viables. Por lo tanto, es importante limitar la cantidad de tiempo que transcurre entre la disección y la colocación de los órganos en la incubadora. La elección del antibiótico es también crucial, ya que muchos antibióticos aminoglucósidos son ototóxicos y puede provocar la muerte de las células ciliadas. A pesar de que es preferible renunciar al uso de antibióticos por completo, lo que deja abierta la posibilidad de contaminación. Por lo tanto, se sugiere el uso de 10 mg / ml ampicilina, como regla general para superar los problemas potenciales de contaminación.

El aspecto más problemático de este y otros procedimientos para el cultivo primario del órgano de Corti, es la tendencia de los órganos de flotar fuera de los platos durante la incubación. Aunque los cultivos flotantes órgano puede permanecer viable durante 5-7 días, hay inconvenientes de los órganos de cultivo flotantes. Por ejemplo, flotando cultivos de órganos a menudo veces sobre sí mismos después de 4-5 días la prestación de microscopía problemática. Posteriormente, la integridad estructural del órgano puede verse en peligro si se compara con los órganos que se han colocado a la cubreobjetos. Hemos encontrado que las siguientes técnicas ayudan a asegurar que el órgano de Corti no flota en el medio de cultivo, pero sigue siendo colocada en el cubreobjetos. En primer lugar, la capa de vidrio en el cubreobjetos 01:01 poliornitina / laminina suplementado con FBS al 20% tal como se describe. La incubación durante la noche las establecidas en el protocolo es el tiempo mínimo que la placa debe ser cubierto. En nuestro laboratorio, a menudo abrigo de todas las planchas que se necesitan para la semana y mantenerse a 4 ° C hasta el día antes de su uso cuando los movemos a la incubadora de una incubación durante la noche. En segundo lugar, después de que los órganos se transportan a la cubreobjetos recubiertos, orientar el explante de manera que los cilios de las células de pelo hacia arriba. Esta orientación facilitará la adhesión de la membrana basilar de la placa de cultivo. En tercer lugar, eliminar los medios de comunicación en el pozo para colocar el explante al plato cubierto. Esto asegurará el contacto entre la placa de cultivo y la membrana basilar y mejorar la capacidad de los explantes de adherirse al vidrio. Esto también ayudará a mantener la integridad estructural de las filas de las células ciliadas. Por último, con cuidado por goteo 2 gotas de medio de cultivo sobre la superficie del órgano de Corti con una pipeta 200 l de capacidad y poco a poco llenar el pozo por goteo y el volumen restante (de un total 130 l) en el lado del cubreobjetos. Es importante trabajar con rapidez para asegurar la fijación del órgano de Corti a la cubreobjetos recubiertos. Desde el inicio de la disección a la incubación de los explantes, por lo general toma 10 minutos para un operador de practica para completar este órgano de Corti procedimiento de aislamiento.

En este protocolo, también se presenta un método para el aislamiento de microorganismos del epitelio sensorial del limbo espiral del órgano de Corti. En este procedimiento, el limbo espiral es diseccionada en el epitelio sensorial con 28G ½ agujas de insulina como herramientas de disección. El resultado consiste en aislar los microorganismos de las filas de las células ciliadas y sus correspondientes células de apoyo (Fig. 3). El epitelio sensorial aislada se puede cultivar como se describe en este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de micro-debe compararse con la separación enzimática de los epitelios sensoriales del tejido circundante ^4. En los mamíferos, así como especies no mamíferas, tales como pollos, la digestión termolisina de que los resultados órganos vestibulares en el aislamiento de los epitelios sensoriales de las células mesenquimales sótano ^4. En la rata cóclea, los resultados termolisina la digestión en la separación de la cresta superior del epitelio, menor cresta epiteliales y el epitelio sensorial que acompaña a la membrana basal ^5. Sin embargo, no está claro si el epitelio sensorial coclear pueden adherirse a las placas de recubrimiento sin las células mesenquimales de acompañamiento. Mientras tanto en el micro-mecánica aislamiento método y el resultado enzimática método de digestión en la separación de los epitelios sensoriales del limbo espiral, las ventajas de la disección de micro-aislar a la digestión termolisina incluye un protocolo relativamente corto, más barato reactivos, y el estrés potencialmente menos el explante debido a los efectos de la digestión enzimática. Además, la membrana basal permanece intacta en este enfoque, que puede mejorar la conexión del epitelio sensorial de la placa de cultivo. Las desventajas de este método incluyen la necesidad de desarrollar las habilidades en la disección delicada y el daño potencial a la mecánica del epitelio sensorial como resultado de la disección micro.

Como ejemplo de la utilidad de este procedimiento, también presentamos un ejemplo de la utilización de los órganos deCorti culturas, la electroporación de genes exógenos en el explante cultura. El procedimiento de electroporación descrito anteriormente se basa en los métodos anteriores de órgano de Corti electroporación. En particular, Zheng y Gao (2000) describen la electroporación de los órganos aislados de ratas de Corti, donde los explantes se mantienen en su lugar para la electroporación por un surco trazado de agarosa y chapada en colágeno recubiertas de 8 y diapositivas Labtek en medio libre de suero ^2. Una de las ventajas de su enfoque es que los órganos están orientados de manera que las superficies superiores de los explantes de la cara del cátodo, que en teoría debería resultar en una distribución uniforme de las células por electroporación en todo el explante. En nuestras manos sin embargo, el método que se describe mejor en este procedimiento debido a que el órgano de Corti quedó fijada en el cubre todo el procedimiento lo que se reduce la manipulación de los explantes después de la electroporación. Además, un porcentaje más alto de los órganos de Corti se mantuvo unido a los cubreobjetos utilizando este método que se presenta. Nuestro método se ha tomado de Jones, et al. (2006) que utiliza la adición de la Fugene 6 reactivo para aumentar la eficiencia de la expresión génica después de la electroporación. En el protocolo de Jones et al. (2006), los órganos se someten a electroporación, se incubó durante 5 minutos con 100 l de reactivo de transfección Fugene 6, y se colocaron ^6. Nuestro método difiere en el uso de una proporción de 3:2 de Fugene 6 reactivo al ADN plásmido, que hemos encontrado empíricamente para proporcionar la expresión transgénica óptima con toxicidad orgánica mínima. Nosotros no usamos sin diluir Fugene 6 reactivo, que puede resultar en toxicidad a los cultivos. La configuración de los electrodos en el protocolo, así como Jones et al. (2006), los resultados en la expresión génica primaria, ya sea en la espiral de limbo o epitelio sensorial dependiendo de la posición del cátodo. Aunque hay DsRed células positivas en el lado lejano de la cultura hacia el cátodo, hay una mayor concentración de células transgénicas más cerca del cátodo. Para asegurar una completa expresión del transgén en ambos lados del órgano de Corti explante, la corriente puede ser revertida por un tren de pulsos segundo, simplemente invirtiendo los cables. Los resultados presentados en el protocolo de sólida expresión de los transgenes a través del órgano de Corti (Fig. 5).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass microscope coverslips	DYNALAB Corporation	2010	10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce
4 ringed cell culture dish	Greiner Bio-One	627170	Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	0.01% Solution
Laminin	BD Biosciences	354232	made in mouse
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140-095	Qualified
Operating scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6806	Straight, sharp-blunt length 5"
#11 Scalpel Blade	BD Biosciences	372611
#4 Dumoxel forceps	Fine Science Tools	11241-30
#55 Dumostar fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Invitrogen	10564-011	High Glucose
Horse Serum	Invitrogen	2605088	Heat Inactivated
Ampicillin Sodium Salt	Invitrogen	11593-027	Irradiated
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe	BD Biosciences	329465	U-100 28G½
Fugene 6 Transfection Reagent	Roche Group	11-815-091-001
Polystyrene test tube	Fisher Scientific	14-956-5A
Laminar flow hood	The Baker Company (Stanford, ME)	Model SG603a	SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Invitrogen	31985
Reporter plasmid	Clontech Laboratories	632539	pCMV DsRed-Express 2
Electroporator	Bio-Rad	165–2662	BioRad Gene Pulser Xcell