Primäre Kultur und Plasmid Elektroporation der Murine Corti-Organ.

Zusammenfassung

Dieses Verfahren beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung der murinen Corti-Organ mit oder ohne die Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Wir zeigen auch ein Verfahren zur Expression eines exogenen Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantat durch Elektroporation.

Zusammenfassung

In allen Säugetieren ist das Sinnesepithel für Vorsprechen an der Spirale des Corti-Organs, die innerhalb der Muschel geformt Cochlea des Innenohres (Abb. 1) befindet sich befindet. Haarzellen in der Cochlea zu entwickeln, die die mechanosensorischen Zellen des auditorischen Systems sind, sind in einer Reihe von inneren Haarzellen und drei (in der Basis und Mitte dreht) bis vier (in der apikalen turn) Reihen von äußeren Haarzellen ausgerichtet dass span die Länge des Corti-Organ. Haarzellen transduzieren Sound-induzierten mechanischen Schwingungen der Basilarmembran in Nervenimpulse, die das Gehirn interpretiert werden können. Die meisten Fälle von Hörverlust sind durch den Tod oder eine Dysfunktion der Haarzellen der Cochlea verursacht.

Ein zunehmend wichtiges Instrument im auditorischen Forschung ist die Isolierung und in vitro-Kultur der Orgel Explantation ^1,2,9. Einmal isoliert, kann die Explantate in mehrere Möglichkeiten, um Informationen über normative, anomale oder therapeutischen Physiologie bieten genutzt werden. Die Genexpression, Stereozilien Motilität, Zell-und Molekularbiologie sowie biologische Ansätze für die Haare Zellregeneration sind Beispiele für experimentelle Anwendungen von Corti-Organ Explantate.

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Corti-Organ von neugeborenen Mäusen. Das dazugehörige Video enthält schrittweise Anweisungen für die Isolierung des Felsenbeins aus Maus-Welpen, und anschließender Isolierung der Cochlea, Ligamentum spirale und des Cortischen Organs. Einmal isoliert, kann das sensorische Epithel überzogen und werden in vitro kultiviert in seiner Gesamtheit, oder als eine weitere seziert Mikro-Isolat, das fehlt der Spirale Limbus und Spiralganglions Neuronen. Mit dieser Methode können primäre Explantate für 7-10 Tage aufrechterhalten werden. Als ein Beispiel für die Nützlichkeit dieses Verfahrens wird Corti-Organ Explantate mit einem exogenen DsRed Reportergen elektroporiert werden. Diese Methode stellt eine Verbesserung gegenüber anderen publizierten Methoden, weil sie reproduzierbar, eindeutig und schrittweise Anweisungen für die Isolierung, Mikrodissektion und primären Kultur des Corti-Organ zur Verfügung stellt.

Protokoll

Tag 1. Sterilisation und Beschichtung von Deckgläschen.

1. Dry sterilisieren Glas-Deckgläsern in einem Autoklaven.
2. Setzen Sie den sterilisierten Deckgläschen in zwei Vertiefungen einer pre-sterilisiert vier gut Zellkulturschale.
3. Bestreichen Sie die Deckgläser mit 1:1 Poly-L-Ornithin und Laminin mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) über Nacht bei 4 ° C ergänzt
   1. 400 ul Poly-L-Ornithin (0,01% ige Lösung bei 4 ° C)
   2. 400 ul Laminin (50 ug / ml Stammlösung in Aliquots bei -20 ° C gelagert)
   3. 200 ul FBS (in Aliquots bei -20 ° C)
4. Heat-Sterilisation die Zerlegung-Werkzeuge über Nacht in einem 150 ° C Inkubator.
5. Machen Kulturmedium mit 10% Serum und 10 mg / mL Ampicillin.
   1. 90 ml Dulbecco Modified Eagle Medium
   2. 5 ml FBS (in Aliquots bei -20 ° C)
   3. 5 ml Pferdeserum (in Aliquots bei -20 ° C)
   4. 10 l Ampicillin (10 mg / ml Stammlösung bei 4 ° C)

Tag 2. Die Isolierung des Corti-Organ.

1. Sterilisieren Sie die positive flow Dissektion Kapuze.
   1. wiederum auf UV-Licht für 20 min
   2. Spray alle Oberflächen mit 70% Ethanol und warten Sie 5 min vor dem Gebrauch.
2. Enthaupten Maus pup (P4) an der Basis des Foramen magnum mit Betriebssystem Schere.
3. Kurz spülen den Kopf in 10 cm Schüssel mit 70% Ethanol.
4. Entfernen Sie die Epidermis mit einem Skalpell.
5. Öffnen der Schädeldecke entlang der Sagittalnaht mit einem Skalpell und dann halbieren Vorderhirn. Bewahren Sie die Schwanzflosse Vorderhirn für die weitere Präparation.
6. Entfernen Sie das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm mit stumpf.
7. Entfernen Sie den zeitlichen Knochen (Abb. 2A), tauchen sie kurz in 70% Ethanol, und übergeben sie an einem 3 mm Schale mit steriler HBSS.
8. Mit einer Pinzette entfernen Sie die Bulla und das umliegende Gewebe vor der Pars petrosa des Schläfenbeins.
9. Suchen Sie die Muschel geformt Cochlea (Abb. 2B) und trennen sie vom vestibulären System mit einer Pinzette.
10. In diesem Stadium der Entwicklung ist das knöcherne Labyrinth nicht vollständig verkalkt und ist leicht seziert mit einer Pinzette. Entfernen Sie die knöchernen Labyrinth der Cochlea durch sorgfältige Trennung ab dem basalen Ende und bewegt apikal mit einer Pinzette.
11. Das Ligamentum spirale und befestigt Corti-Organ befindet sich an der Spirale des Modiolus (Abb. 2C) gewickelt. Entfernen Sie vorsichtig das Corti-Organ durch die Sicherung der Ligamentum spirale am Haken Bereich des Bodens mit einer Pinzette und Abwickeln, wie Sie es apikal zu bewegen.
12. Beginnend an der Basis, entfernen Sie das Ligamentum spirale aus dem Corti-Organ mit Nr. 55 feinen Pinzette (Abb. 2D).
    Micro-Isolierung des Corti-Organ Sinnesepithel (Optional).
13. Entfernen Sie das Corti-Organ Haken Bereich der Basis mit zwei ½ cc Insulinspritzen mit fest angebrachten U-100 28G ½ Nadeln als Pinzette.
14. Beginnend an der Spitze, entfernen Sie die Spirale Limbus aus der Reihe der inneren Haarzellen und gehen basal (Abb. 2E-F).
    Plating Corti-Organ Explantation
15. Entfernen Sie die poly-L-ornithine/laminin/FBS Lösung aus dem Kultur-Wells und fügen 130 ul Kulturmedium.
16. Übertragen Sie die seziert Corti-Organ auf der beschichteten Deckglas in der Kultur gut und orientieren dem Explantat, so dass die Zilien der Haarzellen sind nach oben gerichtet.
17. Entfernen Sie das Medium in der Kultur auch mit einem 200-ul-Pipette. Stellen Sie sicher, dass die Basilarmembran festen Kontakt mit dem beschichteten Deckglas.
18. Vorsichtig 130 ul Kulturmedium der Corti-Organ mit einem 200-ml-Pipette. Tragen Sie zwei Tropfen auf die Oberfläche des Organs von Corti und dann langsam das restliche Volumen auf der Seite des Deckglases. Stellen Sie sicher, dass das Corti-Organ nicht in das Kulturmedium schwimmen, bleibt aber angebracht, um das Deckglas.
19. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in Anwesenheit von 5% CO _2.

Tag 3. Elektroporation des Reportergens in kultivierte Corti-Organ.

1. Entfernen Sie das Kulturmedium aus dem Corti-Organ Kultur.
2. Add 130 ul H ₂ O für 1 min und entfernen Sie dann mit einem 200-ul-Pipette.
3. Add 30 ul DsRed Reporterplasmid (2 mg / mL H ₂ O bei -20 ° C gelagert).
4. Schieben Sie die Elektroden des Elektroporator mit einem Mikromanipulator, so dass die Anode einnd Kathode sind auf beiden Seiten der Kultur.
5. Generieren Sie einen Impuls (27V, 30 ms Dauer, 10 Impulsfolgen) auf das Reporter-Gen in das Corti-Organ Explantation Kultur elektroporieren.
   1. Optional: umpolen des Impulses der Elektroporation des Transgens sowohl auf der modiolar und Ligamentum spirale Seiten der Explantation zu gewährleisten.
6. Warten Sie 5 min.
7. Add 130 ul der Fugene 6: DNA-Lösung (3 Teile Fugene zu 2 Teilen DNA). Diese Lösung sollte vor Beginn der Elektroporation (Schritt 20) mit einem 3 ml Rundboden Polystyrol Reagenzglas in einer Sterilbank vorbereitet werden. Zu dieser Lösung zu machen:
   1. Add 2,4 ul der Opti-MEM (bei ​​4 ° C) in das Teströhrchen.
   2. Add 0,6 ul der Fugene 6 Reagenz (bei 4 ° C) in das Teströhrchen. Achten Sie auf die Fugene direkt in die Opti-MEM und vermeiden Sie direkten Kontakt mit den Seiten des Reagenzglas.
   3. Vortex für 1 Sekunde.
   4. Inkubieren 5 min bei Raumtemperatur.
   5. Fügen Sie 2,0 ul DsRed Reporterplasmid doppelsträngige DNA (bei ​​-20 ° C bei 100 ug DNA / mL H ₂ O Aliquots).
   6. Vortex für 1 Sekunde.
   7. Inkubieren 15 min bei Raumtemperatur.
   8. Geben Sie 200 ul Kulturmedium.
   9. Vortex für 1 Sekunde.
8. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in 5% CO _2.
9. Add 2 mL Kulturmedium, um die Kultur gut und Inkubation für 37 ° C für bis zu 10 Tage.

Repräsentative Ergebnisse

Wir stellen eine Methode zur Isolierung von Corti-Organ aus einer perinatalen Maus. Das Verfahren kann bei Mäusen im Alter von embryonalen Tag 16 bis etwa postnatalen Tag 6 verwendet werden, an welchem ​​Punkt der knöchernen Labyrinth ausreichend verkalkt zu machen das Sezieren umständlich. Sobald das Corti-Organ wird seziert, kann es überzogen und entweder in seiner Gesamtheit (Abb. 3) oder als Mikro-isoliert Sinnesepithel (Abb. 4) kultiviert werden. Wir haben weiter eine Technik, um exogene Gene in den kultivierten Organ Corti ausdrücken vorgestellt. Die organotypischen Kultur ist für viele andere Arten von Studien, wie die Analyse von Corti-Organ Genexpression mittels RT-PCR oder in situ Hybridisierung, Corti-Organ Co-Kultur mit Spirale Ganglienzellen oder exogene Stammzellen mit Hilfe der Mikro-Isolat nützlich ^3, oder in vitro-Analyse von Haaren Zelltod und Regeneration.

Abbildung 1. Querschnitt der P4 murine Corti-Organ. (A) Ein Querschnitt aus der basalen Windung der Cochlea kryogeschnitten von einem P4 Maus erhalten veranschaulicht die allgemeinen Strukturen des murinen Cochlea in diesem Protokoll beschrieben. Die Scala media wird durch die Ligamentum spirale und Stria vascularis seitlich begrenzt, die Reissner Membran s superior, die Spirale Limbus medial und der Basilarmembran inferior. Die Box zeigte die Region in B. ausgebaut (B) Das Corti-Organ auf der überlegenen Seite der Basilarmembran befindet, und umfasst eine Reihe von inneren Haarzellen, drei Reihen von äußeren Haarzellen und ihre jeweiligen Stützzellen. Eine gestrichelte Linie 1 zeigt die Lage entlang der Basilarmembran, die während dieses Organ von Corti Dissektion entfernt wird. Eine gestrichelte Linie 2 zeigt die Lage entlang der Basilarmembran, die während der Mikro-Isolierung Verfahren entfernt wird. Grün bedeutet, immunhistochemische Markierung von Calbindin, die interdentalen Zellen der Spirale Limbus Haarzellen der Cochlea, Spiralganglions Neuronen, sowie Zellen des Ligamentum spirale und Stria vascularis ⁷ Etiketten. DAPI Kennzeichnung der Kerne ist in blau.

Abbildung 2. Corti-Organ Dissektion. Images aus den beigefügten Video des Corti-Organ Dissektion Highlight A) der Cochlea und vestibuläre System innerhalb der isolierten Schläfenbein (rot) befindet, B) das knöcherne Labyrinth der Cochlea, C) des Ligamentum spirale und die angeschlossenen Corti-Organ nach der Entfernung der knöchernen Labyrinth, D) Entfernung des Ligamentum spirale und Stria vascularis (rot) aus dem Corti-Organ, E) Mikro-Isolierung der Sinnesepithel aus der Spirale Limbus (rot) und F) die isoliert Spirale Limbus (links) und Sinnesepithel (rechts).

Abbildung 3. Cultured Corti-Organ Explantation. DIC Bild zeigt das Organ derCorti eines P4 Atoh1-nGFP Maus, isoliert, vergoldet, und kultiviert für fünf Tage, wie beschrieben wurde. Diese Maus wurde gentechnisch so, dass Zellen, die pro-Haarzelle exprimieren Atonal homolog 1 (Atoh1 aka Math1) weisen ein grün fluoreszierendes Protein, das den Kern ⁸ lokalisierte ist. Die Organe des Corti aus diesen Mäusen zeigen eine nukleare GFP-Markierung in allen Haar Zellkerne und ermöglichen somit eine einfache Visualisierung der Sinnesepithel mit einer epifluoreszenten Mikroskop. Die relativ große Spirale Limbus sichtbar seitlich der Sinnesepithel werden. Mesenchymalen Zellen, die aus dem Corti-Organ entstanden sein müssen weg von dem Explantat migriert. Blau nuklearen Etikett DAPI.

Abbildung 4. Micro-isoliert Sinnesepithel. Epifluoreszenz Bild aus dem Sinnesepithel, die von einem P4 murine Corti-Organ wurde wie beschrieben isoliert und über Nacht erhalten. Die Mikro-Isolat wurde dann in 4% Paraformaldehyd fixiert und für die Immunomarkierung von Myosin 7a, die Haarzellen der Cochlea-Etiketten. Beachten Sie das Fehlen der vergleichsweise größeren Spirale Limbus aus der Abbildung 3 dargestellt. Blau nuklearen Etikett DAPI.

Abbildung 5. Elektroporation von DsRed Reportergen in den kultivierten Corti-Organ. Whole Organe des Corti von P4 Atoh1-nGFP Maus Welpen wurden isoliert, vernickelt und dann mit dem Reportergen DsRed wie beschrieben und dann unter einem Mikroskop betrachtet epifluoreszenten elektroporiert. Zellen des Corti-Organ Explantation, dass die transgenen DsRed Reporter exprimiert zeigen eine rote Fluoreszenz und körpereigenen Zellen des Sinnesepithel weisen eine grüne Kernfluoreszenz. Transgene Zellen können durch die Spirale Limbus und Sinnesepithel gesehen werden.

Diskussion

Es gibt mehrere Details, die entscheidend für den Erfolg dieses Verfahrens sind. Je kürzer die Zeit vom Schläfenbein Trennung nach Corti-Organ Inkubationszeit, desto größer ist die Chance, dass die Organe werden dem Deckglas und Ergebnis in tragfähige Organkulturen befestigen. Deshalb ist es wichtig, die Zeitspanne zwischen Präparation und Platzierung der Organe in den Inkubator zu begrenzen. Die Wahl des Antibiotikums ist auch entscheidend, da viele Aminoglycosidantibiotika ototoxischen sind und bleiben im Haar zum Zelltod führen. Obwohl es vorzuziehen ist, den Einsatz von Antibiotika gänzlich zu verzichten, lässt diese die Möglichkeit offen, für Verunreinigungen. Daher empfehlen wir die Verwendung von 10 pg / mL Ampicillin in der Regel auf eine mögliche Kontamination Probleme zu überwinden.

Die am schwierigsten Aspekt dieses und andere Verfahren für die primäre Kultur des Corti-Organ, ist die Tendenz der Organe zu schweben von den Platten während der Inkubation. Obwohl schwimmenden Organkulturen, kann es für 5-7 Tage lebensfähig, es gibt auch Nachteile der Kultivierung schwimmenden Organe. Zum Beispiel, schwimmende Organkulturen oft folden auf sich selbst nach 4-5 Tagen Rendering-Mikroskopie problematisch. Anschließend kann die strukturelle Integrität des Organs beeinträchtigt, wenn die Organe, die dem Deckglas angebracht worden ist verglichen zu werden. Wir haben festgestellt, dass die folgenden Techniken, um sicherzustellen, dass das Corti-Organ nicht in den Kulturmedien float helfen, bleibt aber auf dem Deckglas fixiert. Zunächst beschichten Deckgläschen in 1:1 Polyornithin / Laminin mit 20% FBS, wie beschrieben ergänzt. Die Inkubation über Nacht in diesem Protokoll genannten ist die minimale Zeit, dass die Platte beschichtet werden sollen. In unserem Labor haben wir oft Mantel alle Platten, die wir brauchen für eine Woche und halten sie bei 4 ° C bis zu dem Tag vor dem Gebrauch, wenn wir sie bewegen den Inkubator für eine Inkubation über Nacht. Zweitens, nachdem die Organe sind, um die beschichteten Deckgläsern transportiert, orient dem Explantat, so dass die Zilien der Haarzellen bis Gesicht. Diese Orientierung erleichtern die Einhaltung der Basilarmembran der Kulturschale. Drittens, entfernen Sie die Medien in der auch das Anbringen der Explantation zu den beschichteten Gericht. Dadurch wird sichergestellt, den Kontakt zwischen der Kulturschale und der Basilarmembran und verbessern die Fähigkeit der Explantate auf dem Glas haften. Dies wird auch bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Reihen von Haarzellen zu unterstützen. Schließlich sorgfältig abtropfen 2 Tropfen Kulturmedium auf die Oberfläche des Corti-Organ mit einer 200 ul Kapazität Pipette und dann langsam füllen Sie das auch von tropfenden das restliche Volumen (der insgesamt 130 ul) auf der Seite des Deckglases. Es ist wichtig, schnell zu arbeiten, um die Befestigung des Corti-Organ auf der beschichteten Deckglas zu gewährleisten. Von der Einleitung der Dissektion der Inkubation der Explantate, es dauert normalerweise 10 Minuten für einen geübten Bediener dieses Organ von Corti Trennung abzuschließen.

In diesem Protokoll, stellen wir auch ein Verfahren zur Mikro-Isolierung der Sinnesepithel aus der Spirale Limbus des Corti-Organ. In diesem Verfahren wird die Spirale Limbus vom Sinnesepithel mit 28G seziert ½ Insulin Nadeln Dissektion Werkzeuge. Die daraus resultierenden Mikro-Isolat besteht aus den Reihen der Haarzellen und die entsprechenden Stützzellen (Abb. 3). Die isolierte Sinnesepithel können dann kultiviert wie in diesem Protokoll beschrieben werden. Diese Mikro-Isolierung Verfahren sollte für die enzymatische Trennung der Sinnesepithelien aus den umliegenden Gewebe ⁴ verglichen werden. In Säugetieren, wie auch Nicht-Säuger-Arten wie Hühner, Thermolysin Verdauung der isolierten Vestibularorgane Ergebnisse bei der Isolierung von Sinnesepithelien aus dem Keller mesenchymalen Zellen ^4. In der Ratte Cochlea, Thermolysin Verdauung Ergebnisse bei der Trennung von der größeren Epithelkamm, weniger Epithelkamm und begleitende Sinnesepithelien von der Basalmembran ^5. Es ist jedoch unklar, ob die Cochlea Sinnesepithel können die beschichteten Platten ohne die begleitende mesenchymalen Zellen anzuhängen. Während sowohl die mechanischen Mikro-Isolation-Methode und enzymatische Verdauung Ergebnis der Methode in der Trennung der Sinnesepithelien aus der Spirale Limbus Vorteile der Mikro-Isolat Dissektion über die Thermolysin Verdauung eine relativ kürzere Protokoll, billiger Reagenzien und potentiell weniger Stress dem Explantat durch enzymatische Wirkung der Verdauung. Darüber hinaus ist die Basalmembran intakt gelassen, in diesem Ansatz, der kann Befestigung der Sinnesepithel der Kulturplatte zu verbessern. Nachteile dieser Methode sind die Notwendigkeit, die Fähigkeiten für diese heikle Dissektion und mögliche mechanische Beschädigung der Sinnesepithel aus der Mikrodissektion zu entwickeln.

Als ein Beispiel für die Nützlichkeit dieses Verfahrens stellen wir auch ein Beispiel für die Verwendung der Orgel vonCorti Kulturen, die Elektroporation von exogenen Genen in dem Explantat Kultur. Die Elektroporation oben beschriebene Verfahren basiert auf den bisherigen Methoden der Corti-Organ Elektroporation basiert. Bemerkenswert ist, beschreiben Zheng und Gao (2000), die Elektroporation von isolierten Ratten-Organen Corti, wo die Explantate in Platz für die Elektroporation werden durch eine geformte Nut Agarose gehalten und dann auf Kollagen beschichtet 8-well LabTek Folie in serum-freiem Medium ² beschichtet. Ein Vorteil ihres Ansatzes ist, dass die Organe so orientiert, dass die Oberseiten der Explantate der Kathode, die theoretisch in eine gleichmäßige Verteilung der Elektroporation Zellen in der Explantation sollte Ergebnis Gesicht. In unseren Händen jedoch die Methode, die wir beschreiben, auf dieses Verfahren verbessert, weil das Corti-Organ blieb angebracht, die Deckglas während des gesamten Verfahrens wodurch die Manipulation der Explantation nach der Elektroporation. Darüber hinaus blieb ein höherer Prozentsatz von Organen Corti die Deckgläser mit dieser vorgestellten Methode angebracht. Unsere Methode ist von Jones, et al. (2006) mit dem Zusatz der Fugene 6 Reagenz verwendet, um die Effizienz der Gen-Expression nach der Elektroporation erhöhen übernommen. In der Jones et al. (2006)-Protokoll, sind die Organe elektroporiert, inkubiert für 5 Minuten mit 100 ul Fugene 6 Transfektionsreagenz und vernickelt ^6. Unsere Methode unterscheidet sich in der Verwendung eines 3:2-Verhältnis von Fugene 6 Reagenz Plasmid-DNA, die wir empirisch gefundene optimale transgene Expression mit einem Minimum an Toxizität liefern. Wir wollen nicht unverdünnt anwenden Fugene 6 Reagenz, das kann in der Toxizität der Kulturen führen. Die Elektroden-Konfiguration in unserem Protokoll, sowie Jones et al. (2006), Ergebnisse in primären Genexpression entweder in der Spirale Limbus oder Sinnesepithel abhängig von der Position der Kathode. Obwohl es DsRed-positive Zellen auf der Seite der Kultur fern der Kathode sind, gibt es eine höhere Konzentration von transgenen Zellen näher an der Kathode. Um eine vollständige Expression des Transgens in beiden Seiten des Corti-Organ Explantation, kann der Strom für eine zweite Impulsfolge durch einfaches Umdrehen der führt rückgängig gemacht werden. Das vorgestellte Protokoll Ergebnis sind robuste Expression des Transgens während der Corti-Organ (Abb. 5).

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass microscope coverslips	DYNALAB Corporation	2010	10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce
4 ringed cell culture dish	Greiner Bio-One	627170	Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	0.01% Solution
Laminin	BD Biosciences	354232	made in mouse
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140-095	Qualified
Operating scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6806	Straight, sharp-blunt length 5"
#11 Scalpel Blade	BD Biosciences	372611
#4 Dumoxel forceps	Fine Science Tools	11241-30
#55 Dumostar fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Invitrogen	10564-011	High Glucose
Horse Serum	Invitrogen	2605088	Heat Inactivated
Ampicillin Sodium Salt	Invitrogen	11593-027	Irradiated
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe	BD Biosciences	329465	U-100 28G½
Fugene 6 Transfection Reagent	Roche Group	11-815-091-001
Polystyrene test tube	Fisher Scientific	14-956-5A
Laminar flow hood	The Baker Company (Stanford, ME)	Model SG603a	SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Invitrogen	31985
Reporter plasmid	Clontech Laboratories	632539	pCMV DsRed-Express 2
Electroporator	Bio-Rad	165–2662	BioRad Gene Pulser Xcell