İlköğretim Kültür ve Corti murin Organ Plazmid Elektroporasyon.

Özet

Bu prosedür ya da spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar Corti fare organ izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. Ayrıca elektroporasyon Corti eksplant organ dışsal bir muhabir gen ifadesi için bir yöntem göstermektedir.

Özet

Tüm memeliler, seçmelere için duyu epiteli, iç kulak (Şekil 1) kabuklu şeklinde koklea içinde bulunduğu spiral şeklindeki organ Corti boyunca yer almaktadır. Işitme sistemi mechanosensory hücreleri gelişmekte olan koklea, saç hücreleri tek bir satır ve iç saç hücreleri üç (temel ve orta-dönüşleri) dört (apikal sırayla) dış saç hücrelerinin satır hizalanır Corti organı süresini kapsar. Saç hücreleri, beyin yorumlayabilir sinirsel uyarılara çeviren baziler membran ses kaynaklı mekanik titreşimler transduce. Sensorinöral işitme kaybı vakalarının çoğu koklear saçlı hücreler ölüm veya işlev bozukluğundan kaynaklanır.

Işitsel araştırma, giderek daha temel bir araç izolasyon ve organ ^eksplant 1,2,9 in vitro kültürü . Izole sonra, eksplantlar bilgilere ilişkin normatif, anormal, ya da terapötik fizyolojisi sağlamak için çeşitli şekillerde kullanılabilir. Gen ifadesi, stereocilia motilite, hücre ve moleküler biyoloji, yanı sıra saç hücre rejenerasyonu için biyolojik yaklaşımlar Corti eksplantlar organ deneysel uygulamaların örnekleridir.

Bu protokol, yenidoğan farelerin Corti organı izolasyonu ve kültürü için bir yöntem açıklanır. İlişikteki video fare yavrular temporal kemik izolasyonu için adım adım talimatlar ve koklea, spiral ligament ve Corti organı sonraki izolasyon içerir. Bir kez izole edilmiş, duyusal epitel kaplama ve bütünüyle in vitro olarak kültüre, ya da bir başka disseke spiral limbus ve spiral ganglion nöronlar yoksun olduğu mikro-izole eder . edilebilir Bu yöntemi kullanarak, birincil eksplantlar 7-10 gün süreyle muhafaza edilebilir. Bu prosedürün yardımcı programı bir örnek olarak, Corti eksplantlar organı dışsal DsRed muhabiri gen electroporated olacaktır. Izolasyon, mikrodiseksiyon ve Corti organı primer kültür, tekrarlanabilir, net, ve adım adım yönergeleri sağlar, çünkü bu yöntem yayınlanan diğer yöntemleri üzerinde bir iyileşme sağlar.

Protokol

1. Gün. Sterilizasyon ve cam lamelleri kaplama.

1. Cam mikroskop lamelleri otoklavda sterilize kurulayın.
2. Sterilize lamelleri önceden sterilize dört kuyu hücre kültürü çanak iki kuyu içine yerleştirin.
3. Coat 01:01 poli-L-ornitin ve laminin lamelleri 4 gecede% 20 fetal sığır serum (FBS) ° C ile desteklenmiş
   1. 400 mcL poli-L-ornitin (4 saklanan% 0.01 çözüm ° C)
   2. 400 mcL laminin (50 mikrogram / mL stok çözelti, -20 ° C'de alikotları saklanan)
   3. 200 mcL FBS (-20 ° C'de alikotları saklanır)
4. Isı-150 ° C inkübatör diseksiyon araçları gecede sterilize edin.
5. % 10 serum ve 10 mg / ml ampisilin içeren kültür ortamı olun.
   1. 90 ml Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta
   2. 5 ml FBS (-20 ° C'de alikotları saklanan)
   3. 5 ml at serumu (-20 ° C'de alikotları saklanan)
   4. 10 mcL ampisilin (4 saklanan 10 mg / ml stok solüsyonu ° C)

2. Gün. Corti organı izolasyonu.

1. Pozitif akış diseksiyonu kaput sterilize edin.
   1. 20 dakika UV ışığı açmak
   2. % 70 etanol ile tüm yüzeylerde püskürtme ve kullanmadan önce 5 dakika bekleyin.
2. Işletim makas kullanarak foramen magnum dibinde yavru başını kesmek fare (P4).
3. Kısaca% 70 etanol içeren 10 cm çanak baş durulayın.
4. Epidermis bir neşter bıçak kullanarak çıkarın.
5. Bir neşter bıçak kullanarak sagital sütür boyunca kafatası açın ve sonra önbeyin iki eşit parçaya böler. Daha fazla diseksiyon için kaudal önbeyin saklayın.
6. Künt diseksiyon ile ön beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarın.
7. Temporal kemikleri çıkarın (şekil 2A),% 70 etanol kısaca daldırma ve steril HBSS içeren 3 mm çanak aktarabilirsiniz.
8. Forseps kullanarak, temporal kemik petröz kısmı bül ve çevresindeki doku çıkarın.
9. Kabuklu şeklinde koklea (şekil 2B) bulun ve forseps kullanarak vestibüler sistem ayrı.
10. Gelişme bu aşamada, kemik labirent tamamen kalsifiye ve forseps kullanarak kolayca diseke edilir. Koklea bazal sonunda başlayan ve forseps kullanılarak apikal hareket dikkatli ayrılması ile kemik labirent çıkarın.
11. Spiral ligament ve Corti ekli organ modiolus (Şekil 2C) spiral boyunca kıvrılmış. Corti organı forseps kullanarak taban kanca bölgede spiral ligament ve apikal hareket olarak gevşemek dikkatlice çıkarın.
12. # 55 ince forseps (şekil 2B) kullanan Corti organı üssünde başlayarak, spiral ligament kaldırmak.
    Mikro-izolasyon, Corti duyu epitel (isteğe bağlı) organı .
13. Corti kanca bölgenin iki kullanarak temel organı çıkarın ½ cc İnsülin Şırınga ile kalıcı bağlı U-100 28G ½ forseps gibi iğneler.
14. Apeks başlayarak, iç saç hücrelerinin satır spiral limbus kaldırmak ve dorsalde devam (Şekil 2E-F).
    Corti eksplant organı Kaplama
15. Kültür kuyulardan poly-L-ornithine/laminin/FBS çözüm çıkarın ve 130 ul kültür ortamı ekleyin.
16. Corti organı disseke ve şark kültüründe kaplı cam lamel saç hücrelerinin silya işaret ediyor ki eksplant aktarın.
17. 200 mcL pipet kullanarak kültür orta çıkarın. Baziler membran kaplı cam lamel ile sürekli temas edinceye emin olun.
18. Corti organı, 200 ml'lik pipet kullanarak dikkatlice kültür ortamı 130 mcL ekleyin. Corti organı yüzeye iki damla uygulayın ve sonra yavaş yavaş lamel tarafında kalan hacim kazandırmak. Corti organı lamel yapıştırılmış kalır kültür ortamı yüzer, ama yaptığı emin olun.
19. 37 ° C'de% 5 CO _{2 'nin} varlığı bir gece inkübe edin.

3. Gün. Corti kültürlü organ haline muhabiri gen Elektroporasyon.

1. Corti organı kültür kültür ortamı çıkarın.
2. 1 dakika için 130 mcL H ₂ O ekleyin ve sonra 200 mcL pipet kullanarak kaldırın.
3. Plazmid DsRed muhabiri (-20 ° C'de saklanan 2 mg / ml H ₂ O) 30 mcL ekleyin.
4. Böylece bir micromanipulator kullanarak Elektroporatör elektrotlar Advance anot birnd katot kültürünün her iki tarafta.
5. Corti organı eksplant kültür içine muhabir gen electroporate bir darbe (27V, 30 ms süresi, 10 darbe trenleri) oluşturun.
   1. İsteğe bağlı: modiolar ve eksplant spiral ligament her iki transgen elektroporasyon sağlamak için nabız kutuplarını ters.
6. 5 dakika bekleyin.
7. DNA solüsyonu (3 2 parça DNA parçaları Fugene): Fugene 6 130 mcL ekleyin. Bu çözüm, bir laminer akış kaputu 3 ml'lik bir yuvarlak alt polistiren test tüpü kullanarak elektroporasyon prosedürü start (20 adım) önce hazırlanmış olmalıdır. Bu çözüm yapmak için:
   1. Opti-MEM (4 ° C'de saklanan) 2.4 mcL test tüpüne ekleyin.
   2. Fugene 6 reaktifin test tüpüne 0.6 mcL (4 ° C'de saklanan) ekleyin. Opti-MEM Fugene doğrudan ve test tüpü iki ile doğrudan temas önlemek için emin olun.
   3. 1 saniye vorteksleyin.
   4. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   5. 2.0 mcL DsRed muhabiri plazmid çift iplikli DNA (100 mg DNA / ml H ₂ O alikotları -20 ° C'de saklanan) ekleyin.
   6. 1 saniye vorteksleyin.
   7. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
   8. Kültür ortamı 200 mcL ekleyin.
   9. 1 saniye vorteksleyin.
8. 37 ° C'de% 5 CO ₂ 'gece inkübe edin.
9. 2 ml kültür ortamı kültürü de ekleyin ve 37 ° C de 10 gün öncesine kadar inkübe edin.

Temsilcisi Sonuçlar

Biz perinatal bir fare Corti organı izolasyonu için bir yöntem mevcut. Bu prosedür, kemik labirent diseksiyonu hantal işlemek için yeterli kalsifiye olur ve bu noktada, postnatal günde yaklaşık 16 kadar embriyonik gün gibi genç fareler 6 için kullanılabilir. Corti organı disseke sonra, ya bütünüyle (Şekil 3) veya mikro-izole duyu epitel (Şekil 4) kaplama ve kültürlü olabilir. Biz daha Corti kültürlü organ ekzojen genlerin ifade etmek için bir teknik sunduk. Organotipik kültür Corti gen ekspresyonu RT-PCR veya in situ hibridizasyon, spiral ganglion hücrelerinin mikro-izole kullanarak veya eksojen kök hücreler ile Corti ko-kültür organ organ analizi gibi pek çok çalışma, diğer türleri için yararlıdır ³ veya saç hücre ölümü ve rejenerasyon in vitro analizi.

Şekil 1. Corti P4 fare organ kesiti. (A) P4 fare elde cryosectioned koklea bazal kıvrımı bir kesit, bu protokolde tanımlanan fare kokleanın genel yapısını göstermektedir . Scala media yanal vascularis spiral ligament ve stria ile sınırlanmıştır Reissner s membran süperiora, spiral limbus mediale ve inferiora baziler membran. Kutusu B. genişletilmiş bölge (B) Corti organı baziler membran üst tarafında bulunan ve iç saç hücreleri, üç sıra dış saç hücrelerinin ve kendi destekleyen hücreleri tek bir satır içerir. Kesikli çizgi 1 Corti, bu organ diseksiyonu sırasında kaldırılır baziler membran boyunca yerini gösterir. Kesikli çizgi 2 mikro-izolasyon prosedürü sırasında kaldırılır baziler membran boyunca yerini gösterir. Yeşil immünohistokimyasal etiketleme, spiral limbus interdental hücreler, koklear saçlı hücreler, spiral ganglion nöronlar, spiral ligament ve ⁷ vascularis stria hücrelerinin yanı sıra etiketler Calbindin gösterir. Çekirdeğinin DAPI etiketleme mavi.

Şekil 2. Corti diseksiyonu vurgulamak organ beraberindeki video Corti diseksiyonu Organ Görüntüleri A) izole temporal kemik (kırmızı) içinde bulunan koklea ve vestibüler sistem, B) koklea kemik labirent, C), spiral ligament ve ekli spiral ligament, kemik labirent, D çıkarılmasından sonra Corti organı) kaldırılması ve stria vascularis (kırmızı), E Corti organı) spiral limbus (kırmızı) duyu epitel mikro-izolasyon, ve F) izole spiral limbus (sol) ve duyu epitel (sağda).

Şekil 3. Corti eksplant Kültüre organın organ gösteren DIC görüntüCorti açıklandığı gibi beş gün için, izole, kaplama, ve kültürlü bir P4 Atoh1 nGFP fare. Bu fare yanlısı saç hücresi gen Atonal homolog 1 (Atoh1 aka Math1) ifade hücrelerin çekirdeğini ⁸ lokalize bir yeşil flüoresan protein sergi, böylece genetik olarak tasarlandı. Corti organları bu farelerden alınan tüm saç hücresi çekirdekleri bir nükleer GFP etiketi gösterirler ve bu nedenle duyu epitel epifluorescent bir mikroskop kullanılarak daha kolay görsellik için izin. Nispeten büyük sarmal limbus duyu epitel lateralinde görülebilir. Corti organı kaynaklı mezenkimal hücreler eksplant uzak geçirdim. Mavi nükleer etiket DAPI.

Şekil 4. Mikro-izole duyu epitel açıklanan ve bir gecede kültüre, Corti P4 fare organı izole edilmiştir duyu epitel elde Epifluorescent görüntü . Mikro-izole sonra% 4 paraformaldehid sabit ve koklear saçlı hücreler etiketler Miyozin 7a immunolabeling için işlendi. Şekil 3, nispeten daha büyük bir sarmal limbus olmadığına dikkat edin. Mavi nükleer etiket DAPI.

Şekil 5. Corti kültürlü organ haline DsRed muhabiri gen Elektroporasyon P4 Atoh1 nGFP fare yavrular Corti Tüm organlar izole edilmiştir, kaplama, ve sonra, epifluorescent bir mikroskop altında açıklanan ve daha sonra bakıldığında DsRed muhabiri gen ile electroporated. Transgenik DsRed muhabiri protein ifade Corti eksplant organ hücreleri duyu epitel sergi yeşil bir nükleer floresan kırmızı floresan ve endojen hücreler sergilerler. Transgenik hücrelerin spiral limbus ve duyusal epitel boyunca görülebilir.

Tartışmalar

Bu prosedürün başarısı için kritik olan pek çok ayrıntı vardır. Temporal kemik izolasyon Corti inkübasyon, organları canlı organ kültürlerinde lamel ve sonuç eklemek edeceği büyük şansı organ için kısa zaman. Bu nedenle, diseksiyon ve organları inkübatör yerleştirerek arasındaki süreyi sınırlamak için önemlidir. Antibiyotik seçimi, birçok aminoglikozid antibiyotikler ototoksik ve saç hücre ölümüne neden olacağından da çok önemlidir. Antibiyotik kullanımı tamamen vazgeçmek için tercih edilse de, bu kirlenme olasılığını açık bırakıyor. Bu nedenle, potansiyel kirlenme sorunların üstesinden gelmek için genel bir kural olarak 10 mikrogram / ml ampisilin kullanmanızı öneririz.

Bu en sıkıntılı yönü ve diğer prosedürler Corti organı temel kültür, inkübasyon sırasında plakaları float organlarının eğilimidir. Kayan organ kültürleri, 5-7 gün boyunca canlı kalır rağmen, kültür yüzen organların sakıncaları vardır. Örneğin, mikroskopi sorunlu hale 4-5 gün sonra genellikle kendileri üzerine kat yüzen organ kültürleri. Daha sonra, lamel yapıştırılmış olan organlara kıyasla organın yapısal bütünlüğünü tehlikeye düşer. Corti organı kültür ortamı float olmadığından emin olmak için aşağıdaki teknikleri yardımcı olduğunu bulduk, ancak lamel yapıştırılmış kalır. Birincisi, 01:01 polyornithine / laminin kat cam lamelleri olarak açıklanan% 20 FBS ile desteklenmiştir. Bu protokol adı verilen gecede inkübasyon plaka kaplı olması gerektiği minimum süredir. Laboratuvarımızda, sık sık kat biz bir hafta boyunca ihtiyaç ve 4 tutmak plakaların ° C güne kadar biz onları bir gecede inkübasyon için inkübatör taşıdığınızda kullanımdan önce. İkincisi, organlar saç hücrelerinin silya bakacak şekilde yönlendirmek, kaplamalı lamelleri eksplant taşınır sonra. Bu yönelim, kültür çanak baziler membran bağlılık kolaylaştıracaktır. Üçüncü olarak, eksplant kaplı çanak yapıştırmayın kuyu içinde medya kaldırmak. Bu kültür çanağı ve baziler membran arasında temas sağlamak ve cama yapışır eksplantlar yeteneğini artıracaktır. Bu aynı zamanda saç hücrelerinin satır yapısal bütünlüğünü korumak yardımcı olacaktır. Son olarak, dikkatli bir şekilde yüzeye 200 mcL kapasitesi pipet kullanarak Corti organı kültür ortamı 2 damla damla ve daha sonra yavaş yavaş lamel tarafında kalan hacim (toplam 130 mcL) damlayan tarafından iyi doldurun. Corti organı kaplı lamel eki sağlamak için hızlı bir şekilde çalışmak için çok önemlidir. Eksplantlar kuluçka diseksiyon başlangıcından itibaren, genellikle uygulanan bir operatör için bu organ Corti izolasyon prosedürü tamamlamak için 10 dakika sürer.

Bu protokol, biz de spiral Corti organı limbustan duyu epiteli mikro-izolasyonu için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntemde, spiral limbus 28G kullanarak duyu epitel gaita ½ diseksiyon araçları olarak insülin iğneleri. Mikro-izole saç hücreleri ve bunlara karşılık gelen destekleyen hücrelerin (Şekil 3) satırları oluşur. Bu protokol açıklandığı gibi izole duyu epitel sonra yetiştirilebilir. Bu mikro-izolasyon prosedürü duyu epitel doku ⁴ çevreleyen enzimatik ayırma karşılaştırılmalıdır. Gibi tavuk, bodrum mezenkimal hücreler ⁴ duyu epitel izolasyon izole vestibüler organları thermolysin sindirim gibi memelilerin yanı sıra, non-memeli. Rat koklea, büyük epitel sırt ayrılması, daha az epitel sırt ve eşlik eden duyusal epitelde bazal membran ⁵ thermolysin sindirim sonuçları. Ancak, koklear duyu epitel beraberindeki mezenkimal hücreler olmadan kaplı plakalar ekleyebilirsiniz belirsizdir. Mekanik mikro-izolasyon yöntemi ve enzimatik sindirim yöntemi spiral limbustan duyu epitel ayrılması sonucu, thermolysin sindirim üzerinde mikro-izole diseksiyon avantajları hem de nispeten daha kısa bir protokol, ucuz reaktifler ve potansiyel olarak daha az stres sindirim enzimatik etkileri nedeniyle eksplant. Ayrıca, bazal membran kültür plaka duyu epitel eki artırabilir, bu yaklaşım sağlam bırakılır. Bu yöntemin dezavantajları bu hassas diseksiyon ve duyu epiteli mikro diseksiyon kaynaklanan potansiyel mekanik hasar becerilerini geliştirmek için ihtiyaç içerir.

Bu prosedürün yardımcı programı bir örnek olarak, biz de organ kullanımının bir örnek sunmakCorti kültürleri; eksplant kültür ekzojen genlerin elektroporasyon. Corti elektroporasyon organ önceki yöntem, yukarıda açıklanan elektroporasyon prosedürü dayanır. Özellikle, Zheng ve Gao (2000) eksplantlar elektroporasyon için agaroz bir kalıp oluk tarafından yerinde tutulur ve daha sonra kolajen serum orta ² kaplamalı 8-iyi LABTEK slayt kaplama Corti izole sıçan organlarının elektroporasyon açıklar. Kendi yaklaşımının bir avantajı organları eksplantlar üst yüzeyleri teorik eksplant üzerinde electroporated hücreleri düzgün bir dağıtım sonuçlanması gerekiyor katot, yüz böylece odaklı. Corti organı böylece elektroporasyon sonra eksplant manipülasyon azaltarak işlem boyunca lamel yapıştırılmış kaldı, çünkü bizim elimizde ise, tarif yöntemi bu yordamı geliştirilmiş. Ayrıca, Corti organların daha yüksek bir yüzdesi sunulan bu yöntemi kullanarak lamelleri bağlı kaldı. Bizim yöntemi Jones ve ark (2006) Fugene 6 reaktif elektroporasyon sonra gen ekspresyonu verimliliğini artırmak için ek kullanır alınır. Jones ve arkadaşları (2006) protokolü, organları, electroporated Fugene 6 transfeksiyon reaktif mcL 100 ve ⁶ kaplama ile 5 dakika inkübe. Bizim yöntem Fugene 6 reaktif bir 3:2 oranı minimum organ toksisitesi ile optimal transgenik ifade sağlamak için deneysel olarak bulundu. Plazmid DNA kullanımı farklıdır. Kültürlere toksisite neden olabilir, sulandırılmamış Fugene 6 reaktif kullanmayın. Bizim protokol elektrod yapılandırma yanı sıra spiral limbus veya katot pozisyonuna bağlı olarak duyu epitel birincil gen ekspresyonu Jones ve arkadaşları (2006), sonuçlar. Katot uzak kültürünün yan DsRed pozitif hücreler olmasına rağmen, katot yakın transgenik hücrelerin daha yüksek bir konsantrasyonu vardır. Transgen eksplant Corti organı her iki tarafında tam bir ifade sağlamak için, mevcut yol açar sadece tersini ikinci bir darbe tren ters olabilir. Corti organı (Şekil 5) boyunca transgen sağlam ifade sunulan protokol sonuçları.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass microscope coverslips	DYNALAB Corporation	2010	10mm diameter, circle #1, 1mm thickness, 1 ounce
4 ringed cell culture dish	Greiner Bio-One	627170	Sterilized 35 X 10 mm cell culture dish with 4 inner rings
Poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	P4957	0.01% Solution
Laminin	BD Biosciences	354232	made in mouse
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140-095	Qualified
Operating scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-6806	Straight, sharp-blunt length 5"
#11 Scalpel Blade	BD Biosciences	372611
#4 Dumoxel forceps	Fine Science Tools	11241-30
#55 Dumostar fine forceps	Fine Science Tools	11295-51
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Invitrogen	10564-011	High Glucose
Horse Serum	Invitrogen	2605088	Heat Inactivated
Ampicillin Sodium Salt	Invitrogen	11593-027	Irradiated
½ cc Lo-Dose Insulin Syringe	BD Biosciences	329465	U-100 28G½
Fugene 6 Transfection Reagent	Roche Group	11-815-091-001
Polystyrene test tube	Fisher Scientific	14-956-5A
Laminar flow hood	The Baker Company (Stanford, ME)	Model SG603a	SterileGARD III Advanced Class II Biological Safety Cabinet
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Invitrogen	31985
Reporter plasmid	Clontech Laboratories	632539	pCMV DsRed-Express 2
Electroporator	Bio-Rad	165–2662	BioRad Gene Pulser Xcell