JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذه التقنية تتيح استخدام السحر زاوية عالية الدقة الغزل بروتون MR الطيفي (HRMAS 1H - MRS) لتوصيف الجزيئي للعيش ذبابة الفاكهة السوداء البطن مع مطياف التقليدية تسلا 14.1 مجهزة HRMAS التحقيق.

Abstract

عالية الدقة ماجيك زاوية الغزل (HRMAS) بروتون التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي (

Protocol

الجزء 1 : ذبابة الفاكهة التحضير لقياسات HRMAS

  1. باستخدام معيار flylab الإجراءات 1 ، وجمع الذباب eclosing حديثا لمدة 3 أيام ، ونقل لهم يطير قارورة تحتوي على المواد الغذائية الطازجة الطيران. احتضان الذباب جمعت لمدة 5 أيام حتى يتسنى للذباب ستصبح 5-8 أيام من العمر قبل لمجرد التجربة. ويستخدم واحد فقط الجنس (الذكور عادة) لإجراء التجارب.
  2. استخدام صحية وسليمة نوع الذباب البرية للمقارنة مع العلاج بالصدمة مثل الذباب أو المعدلة وراثيا 1.
  3. المكان الذباب واحد في أنابيب تحتوي على قطعة 2ml (~ 0.2ml) من 24 ساعة طيران الغذاء قبل التجربة. هذه الأنابيب تحمل ثقبا في الكأس أنبوب أدلى به ابرة الانسولين اللهب ساخنة.
  4. وزن الأنابيب على الفور قبل وبعد الإدراج يطير به توازن عالية الدقة وتحديد وزن كل ذبابة ق بطرح القيمة الأولى من هذا الأخير. وذبابة واحدة تزن الذكور عادة 0،7-1 ملغ.

الجزء 2 : إعداد HRMAS الدوار.

  1. وضع أنبوب واحد على الجليد لمدة تقل عن دقيقة واحدة للتخدير داخل الطيران.
  2. وضع الطيران على طبقة من رقائق الألومنيوم وضعت على الجليد ويدفع برفق يطير في الفضاء جوفاء semispherical لإدراج الدوار الرنين المغناطيسي باستخدام فرشاة ناعمة لضمان إكمال الإدراج يطير مع تجنب الاصابة الطيران.
  3. مكان إدراج في أكسيد الزركونيوم (ZrO 2) أنبوب دوار (4 مم ، 50 ميكرولتر) لتحديد موقع الذباب بين الدوار وإدراج السفلي من الدوار (انظر figure1).
  4. إغلاق إدراج مع المسمار ، وتغطي مع parafilm (انظر figure1) لمنع الاحتكاك بين الذبابة والحل القياسية TSP (TSP : trimethylsilyl البروبيونيك - 2 - ،2،3،3 - D4 حمض = 172 ميغاواط ، δ = 0.00 جزء في المليون ، 50 ملم في المياه deuterated - D 2 O ، أن تكون بمثابة مرجع لكل من الرنين التحول الكيميائي والكمي).
  5. إضافة 8 ميكرولتر من محلول TSP القياسية على أعلى إدراج الدوار. (انظر الشكل 1).
  6. آمنة وتشديد كلها التي أقيمت في الدوارات مع غطاء رأس (انظر الشكل 1).

الجزء 3 : HRMAS البيانات اقتناء

  1. أعرض الدوار في التحقيق HRMAS وضعه في زاوية السحر 54.7 درجة (انظر الشكل 1).
  2. ضبط درجة حرارة 4 درجات مئوية وحدة BTO - 2000 بالاشتراك مع وحدة هوائي ماس. يتم الاحتفاظ الذباب عند 4 درجة مئوية بينما في مطياف للحفاظ على التخدير.
  3. تعيين 1 HRMAS معدل MRS H الغزل في ماس 2 كيلو هرتز.
  4. استقرار وتيرة التناوب ماس ب 2.0 ± 0.001 كيلو هرتز قبل وحدة تحكم السرعة ماس (تردد الدوران).
  5. لإعداد مغناطيس : تناغم وتطابق الملف الأداء الأمثل والرقائق المغناطيس للحصول على جودة أفضل من الأطياف.
  6. الحصول على واحد الابعاد أطياف H 1 باستخدام الدوار متزامنة كار ، بورسيل - Meiboom - جيل (CPMG) تسلسل تدور نبض الصدى 2 ، [90 درجة -- (τ - 180 ° -- τ) ن اقتناء] ، والذي يعمل كعامل تصفية ل2 T إزالة الطيفية 1 H NMR توسيع واحد يطير إلى أطياف المكتسبة أحادية البعد بيانات عن جميع العينات. تزامن هذا التأخير بين نبض (τ = 500μs) على وتيرة التناوب ماس (2 كيلو هرتز). تعيين عدد العابرين في 256 مع 32768 (32K) نقاط البيانات. اكتساب الوقت 9 دقيقة.
  7. الحصول على ثنائي الأبعاد (2D) 1 H - 1 H NMR HRMAS احد يطير الأطياف على جميع العينات باستخدام تسلسل TOBSY مع نبضات مكظوم الحرارة 3. المعلمات اقتناء هي : البعد 2K نقاط البيانات مباشرة (11 جزء في المليون عرض الطيفية) ، 1 ق المياه قبل التشبع خلال تأخير الاسترخاء ، و 8 في زيادة عمليات التفحص ، 128 زيادات ، والوقت 2 ثانية التكرار الإجمالي ، و 45 مللي وقت الخلط ، والاستحواذ الكلي الوقت من 29 دقيقة.

الجزء 4 : معالجة البيانات / تحليل

  1. تحليل العينات باستخدام MRspectra MestReC البرمجيات (Mestrelab البحوث وwww.mestrec.com)
  2. استخدام خط الدالة توسيع apodization 0.5 هرتز وتنطبق على جميع FIDS HRMAS H 1 فورييه قبل التحول.
  3. مرجع أطياف MR فيما يتعلق TSP في δ = 0.0 جزء في المليون (معيار خارجي).
  4. أطياف المرحلة يدويا وتطبيق مقدر الأساس ويتاكر للطرح واسعة من المكونات الأساس لحسابات المنطقة قبل الذروة.
  5. تقدير المناطق الذروة باستخدام البرمجيات MestReC. مرتفعات ذروة النطاق فيما يتعلق TSP لكل الطيف المكتسب (TSP ذروة الارتفاع = 1). ر استخدام اختبارات (اثنان الذيل ، ف <0.05) مقارنة داخل المجموعة بين مجموعات النسب.
  6. معلمات 2D عملية TOBSY هي : وظيفة النافذة QSINE = 2 في كل الأبعاد ، مع نقاط FT 2K في البعد المباشر وصفر لملء 1K في البعد الثاني ، في كل مرحلة التصحيح والتصحيح أبعاد أساسية في البعد الثاني.
  7. إنتاج أطياف 2D باستخدام برنامج سباركي (TD غودارد وKneller DG ، الباشق 3 ، USCF ، http://www.cgl.ucsf.edu/الوطن / الباشق /)

الجزء 5 : أطياف من الممثل ايف ذبابة الفاكهة السوداء البطن الذباب

ووصف الإجراءات المذكورة أعلاه تسمح لجمع أطياف استنساخه من الذباب يعيش melanogaster ذبابة الفاكهة. أرقام 2 و 3 تظهر ممثل أطياف MR المكتسبة في البرية من نوع (وزن) أوريغون - R الذباب. ويعرض الشكل 2 1 H 1D أطياف CPMG HRMAS. مكونات الدهون الرئيسية [C H 3 (0.89 جزء في المليون) ، (C H 2) ن (1.33 جزء في المليون) ، C H 2 C - CO (1.58ppm) ، C H 2 C = C (2.02 جزء في المليون) ، C H 2 C = O (2.24 جزء في المليون) ، C = C H H (5.33 جزء في المليون)] ، الجلسرين (1،3 H - C 4.10 جزء في المليون والمليون 4،30 ؛ 2 - CH 2 5،24 جزء في المليون) ، والأيضات الصغيرة : β - ألانين (β علاء تم الكشف عن 2،57 جزء في المليون) ، أسيتات (AC ، 1.97 جزء في المليون) ، phosphocholine (PC ، 3.22 جزء في المليون) وphophoetanolamine (PE ، 3.23ppm) والمعينين وفقا للتقارير السابقة 4 ، 5. تم تعيين إشارات إلى 2،02 جزء في المليون لالبروتونات الميثيلين من شاردة C = CH - CH H2 من أحادية الأحماض الدهنية غير المشبعة (أي palmitoleic). تم التعرف على الأحماض غير المشبعة بإشارة 5.33 جزء في المليون في البروتونات التي تنتجها من طراز CH - CH - = شاردة. تم الكشف عن الأيضات الصغيرة التي لا يمكن التنازل عنه أو لم تكن مرئية باستخدام الطيف 1D 2D باستخدام 1 H - 1 H TOBSY HRMAS (انظر الشكل 3).

figure-protocol-7460
الشكل 1. تجريبية من إعداد في الجسم الحي HRMAS 1H MRS للتحقيق في العيش في ذبابة الفاكهة الحمضية ،2،3،3 14.1 - D4 T. الخارجية القياسية trimethylsilyl البروبيونيك - 2 - في الماء deuterated (TSP / D 2 O). في الساحة : موقف الدوار في زاوية السحر في التحقيق HRMAS.

figure-protocol-7921
الشكل 2. المجراة 1D HRMAS 1 الأطياف CPMG H من ذبابة الفاكهة ذبابة حية بالوزن melanogaster. مكونات الدهون : C H 3 (0.89 جزء في المليون) ، (C H 2) ن (1.33 جزء في المليون) ، C C - H 2 CO (1.58ppm) ، خلات (ميلان) ، C H 2 C = C (2.02 جزء في المليون) ، C H 2 C = O (2.24 جزء في المليون) ، β - ألانين (β علاء) ، phosphocholine (PC) وphophoetanolamine (PE) ، الجلسرين (1،3 - C H 4.10 ، 4.30 جزء في المليون ، 2 - C H 2 5،22 جزء في المليون) ، C = C H H (5.33 جزء في المليون).

figure-protocol-8782
الشكل 3. المجراة في 2D 1H - 1H وقد تم تحديد TOBSY HRMAS طيف ذبابة ذبابة الفاكهة تعيش في وزن melanogaster الأيضات T. 14.1 الصغيرة ومكونات الدهون. الأيضات : ألانين (علاء) ، β - ألانين (β علاء) ، أرجينين (الارجنتين) ، الجلوتامين (GLN) ، الغلوتامات (حمض الغلوتاميك) ، phosphocholine PC (PC) ، phophoetanolamine (PE) ، توراين (تاو) ، α - الجلوكوز (α - GLC) والجلسرين. مكونات الدهون : C H 3 (0.89 جزء في المليون) ، (C H 2) ن (1.33 جزء في المليون) ، C C - H 2 CO (1.58 جزء في المليون) ، C H 2 C = C (2.02 جزء في المليون) ، C H 2 C = O (2.24 جزء في المليون) ، C = C H H (5.33 جزء في المليون).

Discussion

مع استثناء من التقرير الأخير للجدوى في التصوير بالرنين المغناطيسي المجراة في ذبابة الفاكهة 6 ، في الدراسات المجراة في ذبابة الفاكهة MRS لم يتم الإبلاغ عنها. في هذا البروتوكول ، ونحن تصف تنفيذ رواية في HRMAS فيفو نهج H - 1 MRS للكشف عن ...

Disclosures

وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها مستشفى ماساتشوستس العام أبحاث الحيوان المؤسسية اللجنة مراجعة المجلس.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) منحة لورانس G. AI063433 رحمة ، معهد المعاهد الوطنية للصحة (NIH) مركز غرانت (P50GM021700) لرونالد تومبكينس G. (A. الأغنية Tzika ، مدير جوهر الرنين المغناطيسي) ، ومستشفى للأطفال في Shriner منحة بحثية (# 8893) إلى ألف الأغنية Tzika. نشكر Dionyssios Mintzopoulos دكتوراه للحصول على المساعدة في المراحل الأولى من تطوير هذا البروتوكول وأوفيديو جيم دكتوراه Andronesi للحصول على المساعدة مع تسلسل نبض TOBSY.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Deuterium oxideReagentSigma-Aldrich7789-20-0
3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acidReagentSigma-Aldrich24493-21-8
agar, sucrose, yeast, cornmealFoodGenesee Scientifichttp://www.flystuff.com/
Oregon RS or Canton-S fliesAdult fly linesBloomington Stock centerhttp://flystocks.bio.indiana.edu/
PaintbrushEquipment(size 0)
2ml tubesEquipmentFisher ScientificK749521-1590
Fly incubatorsEquipmenthigh humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle.
Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe EquipmentBruker Corporation
BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unitEquipmentBruker Corporation
4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul)EquipmentBruker CorporationB3829 (Bruker store)
MestReC (Mestrelab Research) Software1D NMR spectra analysis
http://mestrelab.com/
SPARKY 3, USCFSoftware2D NMR spectraanalysis
http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/

References

  1. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, 1285-1294 (2009).
  2. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation time. Rev Sci Instrum. 29, 688-691 (1958).
  3. Andronesi, O. C., Mintzopoulos, D., Struppe, J., Black, P. M., Tzika, A. A. Solid-state NMR adiabatic TOBSY sequences provide enhanced sensitivity for multidimensional high-resolution magic-angle-spinning 1H MR spectroscopy. J Magn Reson. 193, 251-258 (2008).
  4. Astrakas, L. G. Proton NMR spectroscopy shows lipids accumulate in skeletal muscle in response to burn trauma-induced apoptosis. Faseb J. 19, 1431-1440 (2005).
  5. Fan, T. W. M. Metabolite profiling by one- and two dimensional NMR analysis of complex mixtures. Prog Nuc Magn Reson Spec. 28, 161-219 (1996).
  6. Null, B., Liu, C. W., Hedehus, M., Conolly, S., Davis, R. W. High-resolution, in vivo magnetic resonance imaging of Drosophila at 18.8 Tesla. PLoS One. 3, e2817-e2817 (2008).
  7. Zektzer, A. S. Improved signal to noise in high-resolution magic angle spinning total correlation spectroscopy studies of prostate tissues using rotor-synchronized adiabatic pulses. Magn Reson Med. 53, 41-48 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

38 MRS HRMAS TOBSY

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved