A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
القياسات المتكررة لفسيولوجيا الجهاز التنفسي القوارض وأخذ العينات من الخلايا الهوائية الملتهبة مرغوب فيها ، ولكن عموما ليست مجدية. نحن هنا تصف طريقة لتكرار intubating شفويا الفئران التي تسمح القياسات المتكررة لhyperreactivity الهوائية وأخذ العينات من الخلايا الهوائية الملتهبة.
hyperreactivity الهوائية (AHR) القياسات وأخذ العينات الشعبى غسل السائل (BAL) ضرورية لنماذج تجريبية الربو ، ولكن إجراءات المتكررة للحصول على مثل هذه القياسات في نفس الحيوان هي عموما ليست مجدية. هنا ، علينا أن نظهر للحصول على البروتوكولات من الفئران القياسات المتكررة لAHR والقصبات عينات السائل غسيل. وقد تم الطعن الفئران الأنف سبع مرات على مدى 14 يوما مع حساسية قوية صورية أو المعالجة. قبل التحدي الأولي ، وفي غضون 24 ساعة بعد كل تحد الأنف ، تم تخدير الحيوانات نفسها ، intubated شفويا والتهوية ميكانيكيا. وتم تحديد AHR ، المقررة بمقارنة منحنيات الاستجابة للجرعة مقاومة الجهاز التنفسي (RRS) الناجم عن زيادة جرعات في الوريد من كلوريد (ACH) أستيل بين الشام وحساسية تحدى الحيوانات. بعد ذلك ، وعبر التنبيب نفسه ، كان lavaged الرئة اليسرى بحيث يمكن أن يؤديها تعداد الفرق من الخلايا الهوائية. هذه الدراسات تكشف أن القياسات المتكررة لAHR BAL وجمع السوائل ممكن من الحيوانات نفسها ، ويتم تحقيق ذلك فرط الاستجابة القصوى مجرى الهواء وكثرة اليوزينيات مجرى الهواء في غضون 7-10 أيام من بدء التحدي حساسية. هذه التقنية الجديدة يقلل بشكل ملحوظ من عدد من الفئران اللازمة لإجراء التجارب الطولية وينطبق على مختلف أنواع القوارض ، ونماذج الأمراض والصكوك الهوائية الفيزيولوجيا.
حساسية التحدي :
التخدير :
التنبيب :
الوريد سطر :
القياسات الهوائية المقاومة :
غسل القصبات :
التوقيت :
في الماوس ، وينبغي اتخاذ الإجراء بأكمله لا تزيد عن 1 ساعة لإنجاز : الخطوة 3-4 ، 5-10 دقيقة ؛ خطوات 21/05 ، 10 دقيقة ، الخطوة 22 ، 20-30 دقيقة ؛ خطوات 23-24 ،... 10 دقيقة. ويمكن تجهيزها مع زيادة الكفاءة والموضوعات مذهلة في البروتوكول ، ما يصل إلى 3 الفئران / ساعة.
ممثل النتائج :
hyperreactivity الهوائية في الفئران ، على النحو الذي يحدده مقاييس القيم 200 PC ، هو نتيجة لتنشيط والتجنيد إلى الرئتين من الخلايا T وإفراز خلوى IL - 135-7. وهكذا ، hyperreactivity الهوائية ليست نتيجة حتمية للتحدي مع حساسية الشعب الهوائية ، ولكن يعتمد بدلا من ذلك على حجيرة تي خلية سليمة المناعة ، والوقت المطلوب للاستجابة خلايا T للتطوير في تحديد تكرار التعرض لمسببات الحساسية. كما هو مبين في الشكل. 2A ، hyperreactivity مجرى الهواء ، كما تم تعريفها 200 PC القيم التي هي أقل بكثير بالمقارنة مع القيم الأساسية والتحديات التي وضعت بعد 5 حساسية مع زيادة كبيرة لا مزيد من التحدي بعد السادسة. وذلك لأسباب ليست مفهومة تماما ، فقد انخفض مجرى التفاعلات (PC 200 قيم زيادة) بعد التحدي حساسية الأول (الشكل 2A). اتجاهات مماثلة واضحة من خلال مقارنة منحنيات الاستجابة للجرعة لمنظمة العمل ضد الجوع الفئران نفسه (الشكل 2B). ومع ذلك ، فمن الواضح هنا أن كامل hyperreactivity مجرى تطور مفاجئ بعد التحدي حساسية الخامسة ، بحيث أصبحت الفئران أكثر من 30 أضعاف أكثر حساسية لمنظمة العمل ضد الجوع بين التحديات الرابعة والسادسة. معا ، وهذه النتائج تشير إلى أن يتم الحصول على قياسات الأكثر موثوقية من التحديات حساسية AHR بعد ستة (12 يوما) ؛ القياسات في وقت سابق timepoints من المرجح أن تسفر البيانات المتغيرة للغاية. الفئران تحدى مرارا مع الأنف السيارة (المالحة) لا تتطور hyperreactivity مجرى الهواء ، وعلى كل جرعة من منظمة العمل ضد الجوع معين ، R RS القياسات لا تختلف كثيرا عن القيم الأساسية (الشكل 3 والبيانات لا تظهر).
قبل ظهور AHR قوية ، وكان نوع من الخلايا المسيطرة على مجرى الهواء الناجم عن الحساسية على العدلات (الشكل 4). مماثلة للاتجاه لAHR ، ومع ذلك ، عززت كثرة اليوزينيات تدريجيا مع تكرار التحدي حساسية ويوزينية أصبح نوع من الخلايا المسيطرة عدديا في السائل AF BALثالثا التحدي السادس ، تتزامن مع انخفاض ملحوظ في أعداد neutrophis (الشكل 4). الضامة في البداية في زيادة عدد مع التحديات حساسية القليلة الأولى ، ويتقلب في الوفرة بعد ذلك. لم فرة اللمفاويات لا يتغير بغض النظر بكثير من عدد من التحديات وحساسية ، نظرا لأهميتها المفارقة الأساسية لهذا النموذج ، وعادة ما تكون الخلية الأقل عددا في السائل BAL.
لم قياسات مقاومة مجرى الهواء لدى الفئران تلقي التحدي لا حساسية ولا أخذ العينات BAL لا يختلف على مدى 17 يوما من التجريب. وأجريت أيضا أخذ عينات السائل BAL المتكررة في غياب قياسات فسيولوجيا التنفس أو حساسية التحدي ، وأظهرت فقط العدلة تعزيز التوظيف والبلاعم إلى الشعب الهوائية التي لم تستمر إلى ما بعد 5 أيام (لا تظهر البيانات). هذه النتائج تثبت أن neutrophilia بارزة لوحظت في الفئران حساسية تحدى هو إلى حد كبير نتيجة لهذا الإجراء ، وليس للمستضد.
في السيطرة ، PBS ، تحدى الفئران ، وقياسات مقاومة مجرى الهواء كما لم تختلف بشكل كبير مع مرور الوقت. واعتبر أيضا تعزيز البلاعم والعدلات ، ولكن ليس يوزينية والتجنيد لBAL السائل في هذه الفئران ، مماثلة لتلك التغيرات الملحوظة في فئران لم تحصل إلا على تكرار أخذ العينات السائل BAL (الشكل رقم 4 ب ، د). معا ، وهذه المعطيات تؤكد أهمية للحساسية ، وليس التلاعب مختلفة من مجرى الهواء ، لتحريض كل من حساسية التهاب الشعب الهوائية (اليوزيني) وAHR.
ويمكن توقع نتائج مماثلة باستخدام المواد المسببة للحساسية الأنف مشابهة للبروتين التي استخدمناها هنا. ومع ذلك ، العديد من المحققين للحث على استخدام ovalbumin الحساسية مرض الرئة. بعد فترة مناسبة من فتيلة أدمية أو داخل الصفاق (1-2 أسابيع) مع ovalbumin عجلت في الملح الألومنيوم ، وهو النمط الظاهري الربو قوية ، بما في ذلك hyperreactivity الهوائية ، يمكن توقع في غضون 24 ساعة بعد الطعن في الأنف واحد مع ovalbumin قابلة للذوبان.
الشكل 1. التمثيل الفوتوغرافي مخطاط التحجم من القوارض ، ومباشرة قبل تسجيل مجرى القياس الفسيولوجي.
الرقم المقاومة إيرواي 2. القياسات. أ) لأغراض الإحصائية ، وتفيد التقارير antilog PC 200 القيم. ملاحظة الزيادة الكبيرة في antilog PC 200 بعد أول تحد وتقلل اللاحقة التالية مزيدا من التحديات. ب) الجهاز التنفسي مقاومة النظام (RRS) : لاحظ شدة الانحدار في منحنيات الاستجابة للجرعة ، منظمة العمل ضد الجوع بعد RRS التحديات السادس والسابع. أشرطة الخطأ تمثل SEM.
الشكل 3. الممثل في الوقت الحقيقي مقاومة الجهاز التنفسي (R RS) اقتفاء أثر من حساسية ساذجة (أ) و 6X تحدى الماوس (ب) تلقي جرعات متتالية الرابع من منظمة العمل ضد الجوع. وتعرض قيم الجرعة في ملغم / كغم من الوحدات.
الشكل 4. التفاضلية عدد الخلايا المناعية في عينات غسيل القصبات المستمدة من الرئتين الأيسر من الفئران التي عولجت مع التحديات 7 الأنف متتالية. النسبة المئوية (٪) وفرة من الخلايا المناعية في الفئران التي عولجت مع مسببات الحساسية (A) أو برنامج تلفزيوني (B). مجموع عدد الخلايا المناعية من الفئران التي عولجت مع مسببات الحساسية (C) أو برنامج تلفزيوني (D). تمثل القيم كما يعني + / -- SEM.
دراسة الربو وانسداد مجرى الهواء ومختلف الأمراض الأخرى ، يشكل حقل نشط ، وتوسيع البحوث الطبية الحيوية. عنصرا هاما من عناصر المتعلقة بالربو البحوث التجريبية هي القدرة على قياس التغيرات في حجم مجرى الهواء تحت ظروف مختلفة. تضييق مجرى الهواء المفرط في الاستجابة لتحدي است?...
نشكر الدكتور جورج Mintzer لاقتراح إجراء التنبيب فموي رغامي الالياف البصرية. بدعم من المنح U19AI070973 ، R01AI057696 ، K02HL75243 وR01HL082487 من المعاهد الوطنية للصحة.
وكان مجرى القياس الفسيولوجي البرنامج (Rescomp) مخصص أعدت (رئيس المجموعة للألفية ؛ 415-519-4371).
وتم تحليل البيانات باستخدام محطة عمل كمبيوتر يعمل بنظام التشغيل ويندوز إكس بي ومجهزة وحدة المعالجة المركزية بنتيوم الثالث (إنتل ، وشركة سانتا كلارا ، كاليفورنيا) والتناظرية 17 - pin لتحويل الاشارات الرقمية (صكوك الوطنية ، # PC - LPM16).
وكان من محطة صغيرة فسيولوجيا الحيوان الهوائية المخصصة تجميعها (الألفية رئيس الفريق) باستخدام محولات الضغط المتاحة تجاريا (الجزء # TRD5700 وTRD4510) ، وحدات preamp (الجزء # MAX2270) ، هيكل (الجزء # MAX1320 ، وكل من شركة Buxco يلمينغتون ، نورث كارولاينا ) والمخصصة مخطاط التحجم الحيوانات الصغيرة.
0.5mm الخارجية القطر الصفحات الألياف البصرية ، وصلة لمصدر الضوء (كول بالمر المنور ، سلسلة 41722)
منفسة (جهاز ماوس مروحة هارفارد ، # 687)
10 ملم وإبر 27ga دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، والقط. رقم 309602)
حرارة المصباح
1 مل حقنة دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، والقط. رقم 305109)
4 المشابك (المهر المشبك ربيع 3200)
0.5 ملم سلك خارجي لدليل التنبيب
عدادة الكريات
شرائح مجهرية Superfrost / الجمع (فيشر القط. رقم 12-550-15)
Shandon تصفية بطاقات (الحرارية القط. رقم 5991022)
الفرق الشريحة الخلية وصمة عار (فيشر القط. رقم 122911)
مجهر ضوئي (لايكا)
Cytospin 3 (Shandon)
20 GA ، 1.25 بوصة ProtectIV القسطرة الوريدية (سميث الطبية)
الألياف الضوئية 0.5 مم البوليمر (ادموند البصريات # NT02 - 532).
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved