에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

요약

쥐 호흡 생리학과기도 염증 세포의 샘플링의 반복 측정이 바람직하지만, 일반적으로 가능하지 않습니다. 여기 구두기도 염증 세포의기도 기능 항 진성과 샘플링의 반복 측정을 허용 쥐를 intubating에 대한 반복 방법을 설명합니다.

초록

기도 기능 항 진성 (AHR) 측정과 bronchoalveolar 세척 (BAL) 유체 샘플링 실험 천식 모델에 필수적인,하지만 같은 동물에서 같은 측정을 얻기 위해 반복 절차는 일반적으로 가능하지 않습니다. 여기, 우리는 생쥐에서 AHR 및 bronchoalveolar 세척 유체 샘플 반복 측정을 얻기위한 프로토콜을 보여줍니다. 생쥐는 치료 효능이 알레르기 항원이나 사기와 십사일 동안 intranasally 일곱 번 도전했다. 초기 도전하기 전에, 각 비강 도전 다음과 같은 24 시간 이내에 같은 동물 구두 intubated와 기계 환기, anesthetized했다. 가짜와 알레르기 항원 - 도전 동물 사이의 아세틸콜린 (이크) 염화의 정맥 복용량을 늘려 유도 호흡기 시스템 저항 (RRS)의 선량 반응 곡선을 비교하여 평가 AHR은, 결정됩니다. 기도 세포의 차동 열거를 수행 될 수 있도록 그 후 같은 삽관법를 통해, 왼쪽 폐을 lavaged되었습니다. 이러한 연구는 AHR 및 BAL 유체 컬렉션의 반복 측정이 같은 동물에서 가능한 것을 공개하고 최대한의기도 hyperresponsiveness과기도 eosinophilia는 알레르기 항원의 도전을 시작의 70~10일 이내에 달성됩니다. 이 소설의 기술은 크게 세로 실험에 필요한 생쥐의 수를 줄이고 다양한 설치류 종, 질병 모델과기도 생리학 장비에 적용됩니다.

프로토콜

알레르기 항원의 도전 :

1. C57BL / 6 마​​우스, 연령 4~8주은 깊은 전신 마취를 달성하는 10 분 동안 산소 증기 혼합물의 3.2 % isoflurane과 정화의 플렉시 글라스 밀폐 챔버에 anesthetized 있습니다.
2. 비강 알레르기 항원의 어려움 (45μL OVA (22.5 μg)과 PBS의 7μL A. Oryzae (7 μg)가) 7 연패 응용 프로그램의 총, 목요일과 일요일, 매주 화요일, 관리하고 있습니다.

마취 :

3. 이전 각 알레르기 항원의 도전, 그리고 7 도전에 따라, 마우스는 전에 빛을 제외 소켓에 배치하기 위해, 48 MG / kg etomidate (2 MG / ML)의 intraperitoneal 주사를 관리하고 있습니다.
4. 관찰할 신경 반응의 부족이 뒷다리 발톱 (5-10 분)을 압력의 신청에 따라 감지 때까지 제목이 소켓에 남아 있습니다.

삽관법 :

5. ~ 37 ° C 바디 코어 온도, 저체온증을 방지하기 위해 절차를 통해 주제에 집중해야의 유지를 보장하기 위해 거리를 유지 복사열 램프. 직장 온도계 상관없이 사용되는 열원의 euthermia을 확인하는 초기에는 최소한 사용해야합니다.
   
   임계 단계 실험 동물받은 모든 유체 기기는 멸균되어야, 절차가 엄격한 무균 조건 하에서 수행되어야합니다. 마취 동안 장시간 저체온증은 동물의 탈선 데이터 및 / 또는 사망으로 이어질 것입니다. 모든 침입 절차 능력은 살아있는 동물에서 작업을하기 전에 시체 같은 동물을 사용하여 개발해야합니다. 안과 윤활유는 전신 마취하에 동물의 각막 찰과상을 방지하기 위해 사용해야합니다.
6. Anesthetized 마우스를 소켓에서 제거하고 plethysmograph 테이블에 가로 누운 위치 (복부 측면까지)에 배치되며, 45 ° 각도로 조정.
7. 테이블을 encircling 고무 밴드가 너무 장소로 피사체를 확보 incisors의 맨 윗줄 뒤에 삽입됩니다. 오른손에 핀셋으로, 손잡이는, 확장, 그리고 왼손에 억압자 금속과 장소에 그것을 확보하기 전에 입안에서 혀를 리프트, 따라서 삽관법에 대한 unimpeded기도를 수 있도록합니다.
8. 광원에 연결된 0.8 mm 직경의 fiberoptic 스레드는, angiocatheter을 통해 삽입 팁 넘어 10mm를 연장됩니다. 억압자가 왼손으로 steadied이기 때문에 보컬 화음이 시각까지, fiberoptic 스레드의 조명 끝을 오른손으로 구강 및 인두 거치게됩니다. 스레드가 다음 이동 성대 통하여 기관에 직접 시각화에 따라 전달, 코드가 maximally 열 때 발생하는 시간이 초과되었습니다.
9. 카테 테르 팁이 기관의 중간 부분 내에 자리잡고 때까지 angiocatheter은 다음 기관에 fiberoptic 스레드를 통해 전달됩니다. 17-22g 마우스의 경우, 이것은 커넥터와 피사체의 아래턱의 두개골 극단 사이에 보이는 남아있는 10mm의 카테 테르 세그먼트에 해당합니다. 카테터를 전달하는 실제 금액은 해당 크기와 유전 배경로부터 2-3 catheterized 생쥐의기도의 직접 검사에 의해 결정되어야합니다.
10. 바로 엄지와 커넥터의 다음과 같은 폐색을 해지할 일반 심호흡 (흉부와 복부의 리듬 여행)을 관찰하여 fiberoptic 스레드가 제거되고 성공 삽관법이 확인됩니다. 숨이 응답에 관계없이 엄지 손가락 폐색, 불규칙 호흡, 또는 어려움 호흡의 다른 흔적 malpositioning 주로 식도 삽관법를 나타내는 angiocatheter 나타내는 있습니다.
    
    빠르게 식도 삽관법을 반대로 임계 단계 실패 치명 수 있습니다. 식도 삽관법이 의심되면, 카테터가 신속하게 제거되어야하며 동물이 정상적인 호흡 패턴을 재개되면 다시 삽입. Etomidate 가능한 모든 쥐 anesthetics의로 선택의 마취,이 에이전트는 최소한 심장 독성 (저혈압, 부정맥, 심장 마비) 전달.
11. 낮은 plethysmograph 테이블 작업 벤치와 공기 환풍기 포트를 직면하기 전까지 주제 180 ° 회전과 평행까지. 환풍기에 연결하기 전에 측면에 동물을 켭니다.
12. 빵빵한 연결을 확보하고 호흡기 (150 호흡 / 분, 9 ML / G 갯벌 볼륨, 100 % 산소로 작동) 활성화 후 thoracoabdominal 여행은 환풍기와 속도로 볼 때, 성공 삽관법가 추가로 확인됩니다.

정맥 라인 :

13. 베벨의 각도로 얼굴을 너무 10mm는 27ga 주사 바늘은 무료로 녹고있어, 그리고 살균 포셉 및 hemostat를 사용하여 미드에서 바늘을 90 ° 굴곡의 방법으로 자사의 주사기 - 커넥터에서 제거됩니다. 비 - beveled 끝을 IV 주입 포트에 이어지는 PE10 튜브에 연결되어 있습니다.
14. 잠재적으로 방지하기 위해치명적인 공기 embolization, 튜브와 바늘은 37로 정화 아르 ° C, 1 ML의 주사기를 통해 NaCl 0.9 %. 사출 포트는 15ml 원심 분리기 튜브의 뚜껑에 구멍을 뚫고 끝까지 해냈고 27ga 바늘로 이루어져 있습니다. 뚜껑 그러므로 공기가 주사 바늘에 개입하고 정맥 주입된다는 가능성을 감소, 바늘의 끝 부분이 지속적으로 변할 것을 호수 등으로 가득합니다.
15. 가열 램프 아래에 남아있는 마우스로, 주사 바늘로 꼬리 병렬의 꼬리 극단에서와 측면 정맥을 통해 정렬됩니다. 정맥의 길이를 따라 cranially 감독과 구부 subcutaneously 강요하면서 바늘이 피부 밑에 약간 실행됩니다. 성공 IV 배치는 주사기의 플런저를 약간 당기와 IV의 튜브에 혈액 역류를 관찰하여 확인됩니다. 또한 꼬리 정맥에 50-100 μl 호수의 주입시 IV 라인을 통해 흐름을가 unimpeded해야합니다. 가끔 꼬리 정맥은 안정 cannulated 수 없습니다. 이러한 경우에, 마우스는 다른 측면과 IV 일반적으로 어려움없이 접근할 다른 꼬리로 180도 회전 수 있습니다.
16. 설치에서 가열 램프를 제거 후, ​​주제는 이후 4 클램프의 응용 프로그램과 빵빵한으로 보안, plethysmograph에 포함되어 있습니다.
    
    가열 램프가 남아 허용 임계 단계는 plethysmograph 챔버에서 공기를 가열하고 잠재적으로 유지되어야 IV의 바늘과 솔루션의 R _RS의 불임증의 후속 측정을 변경합니다. 바늘의 살균은 immersing과 rinsing 사전 IV 삽입하기 위해 멸균 생리 식염수와 플러싱 다음 70 % 에탄올로 플러싱에 의해 수행됩니다. 또한, 꼬리는 70 %의 에탄올 혹은 IV 삽입하기 전에 이소 프로필 알코올로 세척해야합니다.

기도 저항 측정 :

17. 피크 저항이 지수의 지속적인 quantitation에 의해 결정됩니다 DPt / V (어디 DPt는 tracheal 압력의 변화이며, V는 공기 흐름)을 동등 폐 볼륨의 포인트 (70 % 조수 볼륨)에서. DPt은 tracheal angiocatheter에 연결된 압력 변환기를 사용하여 결정됩니다. V를 확인하려면 plethysmograph 압력 변화는 공부 physiologic 범위 이상의 볼륨의 변화에​​ 조정됩니다. 로 preamp 모듈에 의해 계산된 시간이 지남에 따라 plethysmograph 볼륨의 차이는 안정적인 기준을 맺은 후 V.입니다 R _RS (삼분 이상 <5 % 편차), 증가 다섯 연속 복용 (부피 = 2 G / μl 체중) 아세틸콜린 염화 (0.058, 0.18, 0.59, 1.58 및 5.8 MG / 체중 kg, 산도 7.4에서 0.9 %의 식염수에 얼음 전에 각각의 주입을 손으로 따뜻하게에서 유지)의 농도는 IV를 통해 일초 이상 주사 (약 12cm H ₂ O X ML ^-1 X 초, 즉, 약 4cm의 일반적인 기준 이상의기도 저항에 200 % 증가 기준 저항의 tripling까지 기본으로 R _RS의 반환에 따라 실시 이후의 각 복용량과 함께 H ₂ O X ML ^-1 X 초)이 이루어진다. 기본 값 (PC ₂₀₀ 칭했다)에서 R _RS에 200 % 증가의 원인이 체중의 MG / G,에 이크의 도발적인 농도는 이크 - R _RS 선량 - 반응 곡선의 수학적 보간으로 계산됩니다.
18. 일단 PC ₂₀₀ 값, 릴리스 체결에 도달하고 plethysmograph을 해체되었습니다. 이크 5 증가 복용의 최대 주어집니다. 위에서 언급 한대로 이크 농도 범위는 대부분의 순진 마우스 종자에 대한 PC ₂₀₀ 값을 달성에 적합합니다.
    
    약 4cm H ₂ O X ML ^-1 X 초의 기준이 30 초 동안 저항 모니터에 설립 임계 단계는 정상적인 생리의 60 μL은 IV가 마취의 적절한 비행기가 달성되었는지 확인하기 위해 주입 수 있습니다. 완료 마취와 저항에 큰 변화가 없을 것입니다, 손발이나 꼬리의 저항이나 운동의 증가는 신체적 고통의 기호를 나타내는 추가 마취의 필요성을 나타냅니다.
19. 꼬리 정맥에서 IV를 제거하고 다음 장소에서 tracheal 정맥을 유지하여 특허기도를 유지, 인공 호흡 상태에서 동물을 분리합니다. 수시 동물 즉시 자발적인 호흡을 다시 시작하지. 이러한 경우에, 호흡은 부드럽게 마사지하여 근육을 격려 수 있습니다.
    
    임계 단계 자연 호흡은 복구 챔버로 전송하기 전에 설정해야하고, 그렇지 않으면 죽음은 발생합니다.
20. 자발 호흡 재개되면, 생쥐는 37 100 % O ₂ 및 유지 관리와 정화 실내로 장소에서 tracheal 캐뉼러로 전송됩니다 ° C 가열 램프를 사용합니다. 15-20 분 이내에 쥐가 강력하게 호흡하고 tracheal 카테터를 제거하고 동물의 수있는 시점에서, 그들의 사지를 이동하기 시작afely 그들의 일반적인 버팀대로 전학 왔어.
    
    임계 단계는기도는 쉽게 아세틸콜린 유발 하이퍼 타액의 분비로 인해 무의식적인 마우스의 방해와기도 physiologic 측정 다음 anesthetized 마우스에 질식 관련 사망의 주요 이유입니다. 이런 이유로 들어, tracheal 정맥 그들은 arousable하고 하이퍼 salivaton가 정지 때까지 제거하지 않아야 때까지, 심지어 bronchoalveolar 세척을 진행하지 마우스에 위치에 있어야합니다.

Bronchoalveolar 세척 :

21. 마우스가 충분히 자신의 개그 반사를 (복구 챔버에 배치 후 ~ 20 분) 복구할 때 bronchoalveolar 세척 유체의 수집은 안전합니다. 구역질 반사가 부드럽게 angiocatheter가 안쪽과 바깥쪽으로 슬라이딩에 의해 평가되며 분명 기침이나 고민은 구역질 반사가 반환했음을 나타냅니다.
    
    허용 임계 단계도 복구 시간을 연장하는 것은 크게 개인 생쥐에서 BAL 반환의 효율성을 감소 것이며 따라서 구역질 반사가 제안하는 20 분 휴식 기간에 따라 몇 분 간격을 모니터해야합니다. 쥐가 부분 각성에 의한 세척 절차를 참을 수 없다면, 3.2 % isoflurane 증기 마취를 사용할 수 있습니다.
22. ~ 30 ° 폐의 왼쪽 엽으로 이동의 연속 벤드와 금속 삽관법 가이드 와이어 (0.5mm OD)는, angiocatheter에 삽입됩니다. 가이드 와이어와 angiocatheter은 카테 테르가 (허브 제외) 단 1mm에 의해 앞니 초과 등 즉, 폐의 왼쪽 엽에 함께 고급 있습니다.
    
    동물 죽음의 가능성을 높이는 동시에 왼쪽 폐를 분리에 중요한 단계 실패 크게, 이윤율을 줄일 수 있습니다. 케어는 가이드 와이어의 끝은 angiocatheter의 열린 끝을 통과하지 않도록하기 위해 이동해야합니다. 튀어나온 금속 팁과 angiocathether을 발전하면 tracheal 열상 및 tracheal 파열로 인한 죽음을 초래할 수 있습니다.
23. 장소에 angiocatheter을 유지, guidewire를 제거하고 PBS 300 μL입니다 (산도 7.4, 멸균) 1 ML의 주사기를 통해 왼쪽 폐에 플러시됩니다. 즉시 부정적인 압력을 만들 수있는 주사기의 플런저를 그리는 동안 angiocatheter가 강렬한 폐를 마사지하는 동안 제거 (3 S) 천천히, 이후. 100-200 μL의 BAL 반환이 예상된다.
24. 바로 37 ° C, 100 % O ₂ 챔버 계속 흉부을 마사지하면서시오. lavaged 마우스를 반환 자신의 왼쪽에 플레이스 마우스 완전히 (~ 20 분)까지 회복. 동물은 그들의 새장에 다시 배치됩니다.

타이밍 :

마우스에 따르면, 전체 절차는 수행 1 시간보다 더 오래 걸릴해서는 안 : 3-4, 50-10 분 단계, 단계 5-21, 10 분, 스텝 22, 20-30 분, 23-24 단계,... 10 분. 증가 실력과 프로토콜에 엄청난 과목으로, 최고 3 마우스 / 시간을 처리할 수 있습니다.

대표 결과 :

로 PC _200의 가치 측정에 의해 결정 생쥐의기도 기능 항 진성은, 시토킨 IL - 135-7의 T 세포와 분비의 폐에 활성화 및 채용의 결과입니다. 따라서기도 기능 항 진성은 알레르기 항원과기도 도전의 피할 수없는 결과 아니라, 오히려 손상 T 세포 면역 구획 반복 알레르기 항원 노출의 설정에 개발하기 위해 T 세포 응답에 필요한 시간에 따라 달라집니다. 마찬가지로 그림에 표시됩니다. 2A,기도 기능 항 진성은 크게 여섯 번째 도전 후 넘어올 크게 증가 5 알레르기 항원의 도전 이후 개발 기본 가치에 비해 낮은 PC ₂₀₀ 값으로 정의. 완전히 이해되지 않은 이유기도 반응은 첫 번째 알레르기 항원의 도전 (그림 2A) 이후 (PC ₂₀₀ 값이 증가) 감소. 비슷한 경향은 같은 생쥐 (그림 2B)에 대한 이크 선량 반응 곡선을 비교하여 확실하고 있습니다. 그러나, 전체기도 기능 항 진성이 갑자기 다섯 번째 알레르기 항원의 도전 이후 개발되는 여기 분명이며, 그러한 것을 마우스는 30 배 이상이 될 네 번째, 6 과제 사이 이크 더 민감. 함께, 이러한 연구 결과는 AHR의 가장 신뢰할 수있는 측정 6 알레르기 항원의 어려움 (12 일) 이후에 얻은 것을 나타냅니다; 이전 timepoints의 측정은 대단히 변수 데이터를 얻을 가능성이있다. 반복 차량 intranasally (호수)와 도전을 마우스기도 기능 항 진성을 개발하지 않으며, 주어진 이크의 복용에서 R _{RS 측정} 크게 (그림 3 표시되지 데이터) 기본 값에서 다양하지 않습니다.

이전 강력한 AHR의 출현으로, 알레르기 항원에 의해 유도기도의 지배적인 세포 유형은 호중구 (그림 4)되었습니다. AHR에 대한 추세와 마찬가지로 그러나, eosinophilia 점차 반복 알레르기 항원의 도전과 eosinophil가 BAL 유체 AF의 숫자 지배적인 세포 유형되었습니다 강화neutrophis 번호에 표시된 감소 (그림 4)와 일치 터 여섯 번째 도전. Macrophages 처음 처음 몇 알레르기 항원 과제 번호가 증가하고 이후 풍부하게 오르 내렸는지를 보여준다. 림프구 풍부 크게 관계없이 알레르기 항원의 도전의 수를 변경하고, 역설 모델들의 기본 중요성을 감안할 때, 일반적으로 BAL 유체에서 가장 많은 세포 수 없습니다 않았다.

알레르기 항원의 도전이나 BAL 샘플링도 수신을 마우스에서기도 저항 측정 실험 17 일 동안 다양하지 않았다. 기도 생리 측정이나 알레르기 항원의 도전의 부재에서 반복 BAL 유체 샘플링도 수행하고, 오일 (데이터가 표시되지 않음) 이상 유지되지 않은기도에만 향상된 호중구 및 대식 세포 모집을 보여주했다. 이러한 연구 결과는 알레르기 항원 도전 생쥐에서 관찰 유수 neutrophilia가 크게 절차 아니라 항원의 결과임을 보여줍니다.

컨트롤에, PBS는 - 도전 쥐를,기도 저항 측정은 시간이 지남에 따라 상당히 다를하지 않았다. 향상된 대식 세포 및 호중구 아니지만 BAL 유체에 eosinophil, 채용도서만 반복 BAL 유체 샘플링 (그림 4 B, D)를받는 생쥐에서 관찰 이러한 변화와 유사한 이러한 마우스에 보였다. 함께, 이러한 데이터는 알레르기 (호산)기도 염증과 AHR 모두의 유도로,기도의 다른 조작을 알레르기 항원의 중요성을 강조하고,하지 않습니다.

비슷한 결과는 우리가 여기에 사용한 proteinase 유사 비강 알레르기를 사용하여 기대하실 수 있습니다. 그러나 많은 조사는 알레르기가 폐 질환을 유발하는 ovalbumin을 사용합니다. ovalbumin과 intradermal 또는 intraperitoneal 마중물 (1~2주)의 적절한 기간이기도 기능 항 진성 포함한 알루미늄 소금, 강력한 천식 표현형에 시켰던 후 녹는 ovalbumin과 함께 하나의 비강 도전 후 24 시간 이내 기대하실 수 있습니다.

그림 1. 쥐 plethysmograph의 사진 표현,기도 생리학 측정 녹음 즉시 사전.

그림 2. 에어웨이 저항 측정. A) 통계 목적, antilog PC ₂₀₀ 값은보고됩니다. 추가로 다음과 같은 도전에 첫 도전 이후 감소 후 antilog의 PC _200의 큰 증가합니다. B) 호흡기 시스템 저항 (RRS)는 : 여섯째 그리고 일곱 번째 도전 후 이크 - RRS 선량 - 반응 곡선의기구를합니다. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다.

그림 3. 대표 실시간 호흡기 저항 (R _RS) 이크의 연속 IV 투입을 수신 마우스를 도전 순진한 (A) 및 배의 알레르기 항원 (B)에서 tracings. 선량 값은 MG / kg 단위로 표시됩니다.

그림 4. 7 연속 비강 도전 대우 마우스의 왼쪽 폐에서 파생 bronchoalveolar 세척 샘플에서 차동 면역 세포 계산됩니다. 알레르기 항원 (A) 또는 PBS (B)로 치료 생쥐의 면역 세포의 비율 (%) 풍부한. 알레르기 항원 (C) 또는 PBS (D)로 치료 생쥐에서 면역 세포의 총 수입니다. SEM - 값 + / 의미로 표현.

토론

천식의 연구 및 기타 다양한기도 폐쇄 질환은 생명 의학 연구의 활성화 및 확장 필드를 구성합니다. 천식 관련 실험 연구의 중요한 요소는 다양한 조건 하에서기도 크기의 변화를 측정하는 능력이다. 도발적인 도전, 천식과 관련된 폐 질환의 정식 기능과기도 칭했다기도 hyperresponsiveness의 속성에 대한 응답으로 과도한기도 축소는, 호흡과 죽음 등 다른 증상의 곤란에 이르는 임상 상당한 공격의 ?...

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