عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي (HUVEC)

Summary

هذا البروتوكول فيديو يوضح العزلة وثقافة الإنسان الخلايا البطانية الوريد السري (HUVEC) من الحبل السري البشري. مرة واحدة معزولة يمكن استخدام هذه الخلايا لتكوين الأوعية الدموية في المختبر فحوصات مثل الفحص الفايبرين محسن الخرزة جل أظهرت أيضا من قبل مختبر هيوز.

Abstract

الأوعية الدموية هي عملية معقدة متعددة الخطوات العملية ، حيث استجابة لمحفزات عائية ، يتم إنشاء السفن الجديدة من الأوعية الدموية الموجودة. وتشمل هذه الخطوات : تدهور انتشار الطابق السفلي ، والغشاء والهجرة (تنبت) من الخلايا البطانية (EC) في المصفوفة خارج الخلية ، والمحاذاة من المفوضية الأوروبية في الحبال ، وتشكيل التجويف ، مفاغرة ، وتشكيل الغشاء القاعدي الجديد. وقد وضعت العديد من فحوصات المختبر لدراسة هذه العملية ، ولكن معظم فقط تحاكي مراحل معينة من الأوعية الدموية ، وتتشابه هذه السفن غالبا ما لا تشبه السفن في الجسم الحي. نحن هنا تدل على وجود الأمثل في المختبر فحص الأوعية الدموية التي تستخدم الإنسان السري EC الوريد والليفية. يلخص هذا النموذج جميع المراحل المبكرة من الأوعية الدموية الرئيسية ، والأهم من السفن عرض شمعة البراءة بين الخلايا محاطة EC الاستقطاب. ويمكن ملاحظتها بسهولة السفن على النقيض من المرحلة المجهري ومرور الزمن ، وانتعشت في شكل نقي للتطبيقات المصب.

Protocol

إجراء

1. وضع الحبل على لوحة نظيفة وربت قبالة الدم الزائد. إجراء تخفيضات جديدة على طرفي الحبل.
2. إدراج 21 02/01 إبرة G مع غمد إبرة بلاستيكية ON ، في الوريد. (وريد هو أكبر الافتتاح ، وتلك هي أصغر الشرايين 2)
3. المشبك الإبرة في مكان مع مرقئ ونعلق 20cc المحقنة من الإبرة إلى هانكس.
4. دفع هانكس عن طريق الوريد مع الضغط المعتدل. جمع النفايات في الدورق مع التبييض. (القابضة الإبرة والحبل بيد واحدة بينما يدفع من شأنه أن يمنع الإبرة تفرقع من الوريد). إذا كان هناك الكثير من الدم في الوريد ، ويغسل مرة ثانية.
5. وضع الحبل على وسادة والمشبك في الطرف الآخر من الوريد. ملء مع قليل من مل هانكس لفحص للكشف عن التسربات على طول الحبل. سحب 5 مل وقطع الشبك السفلي.
6. قطع المحقنة 20cc. إزالة المكبس من المحاقن 10cc. نعلق حقنة 10cc إلى الإبرة ، وتصب في كولاجيناز 10ML واستبدالها المكبس. دفع كولاجيناز في الوريد حتى ترى المبلغ الأول خروج من نهاية مفتوحة. إعادة المشبك نهاية مفتوحة وتمتلئ كولاجيناز حتى يكون هناك انتفاخ معتدلة من الوريد. النتائج انتفاخ كثيرا في تلوث العضلات الملساء.
7. تدليك الحبل بلطف.
8. الحبل احتضان (مع الإبرة ، والمحاقن المرقأة المرفقة) في DPBS عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
9. في حين يحتضنها ، ومواصلة الخطوات 1-8 مع الحبل ^{الثانية} 2.
10. بعد مرور فترة الحضانة ، واتخاذ الحبل من الدورق وبينما يمسك الحبل على خفض أنبوب 50mL نهاية فوق الشبك السفلي. تأكد من جمع كل شيء في الأنبوب. دفع كولاجيناز المتبقية من خلال الحبل السري ، ثم نعلق المحقنة 20cc هانكس ، ودفع من خلال الضغط مع المعتدلين.
11. إذا كنت لا حاجة لخلايا العضلات الملساء ، تجاهل الحبل في هذا الوقت. خلاف ذلك ، وضع نفسه في سلك أنبوب 50mL الثانية مع كولاجيناز ~ 5ml واحتضان لفي 37 دقيقة 30-60 درجة مئوية.
12. إبقاء الأنبوب حتى تتم جميع الحبال.
13. تدور الأنابيب في 1200 دورة في الدقيقة ~ لمدة 5 دقائق.
14. نضح طاف (باستثناء 1-2 مل ~). Resuspend لبيليه في PHEC 5mls + و لوحة في T25.
15. احتضان عند 37 درجة مئوية مع CO ₂ 5 ٪ بين عشية وضحاها.
16. اليوم التالي إزالة طاف واستبدالها مع وسائل الإعلام الجديدة. إذا كان هناك العديد من كرات الدم الحمراء ، ويغسل مرة واحدة مع M199 ، ثم إضافة + PHEC. مواصلة احتضان كالمعتاد حتى يتم لوحة متموجة (1-4 أيام). انقسمت الى T75 gelatinized.
17. T75 بمجرد متموجة ، تنقسم إلى ثلاثة T75s. تجميد two القنينات في القارورة.

ملاحظة : الخلايا البطانية (unactivated) لها مظهر الحصوه. أحيانا يتم تنشيط خلايا بطانة الأوعية الدموية (طويل ومدبب) اليمين بعد العزلة ، وبعد بضع يمر عادة عودتهم الى دولة unactive.

تنظيف

1. بعناية شديدة ، والتخلص من الإبر الحادة في حاويات.
2. تخلص من المحاقن في حاوية بيولوجية كبيرة.
3. تطرح جميع أنسجة واقية في كيس صغير. إغلاق الكيس والتجميد في -20 درجة حتى الحرق.
4. نقع في جميع الصكوك مبيد للفيروس على الأقل 10 دقيقة.
5. إضافة إلى وسائل الإعلام حضانة النفايات دورق / التبييض. اسمحوا الجلوس لمدة لا تقل عن 10 دقيقة.
6. تجاهل منصات مقاعد البدلاء إلى نفايات بيولوجية.
7. رذاذ باستمرار داخل وخارج الأكواب ، أعلى مقعد وغطاء حمام مائي مع vircide. اسمحوا الجلوس 10 دقيقة ، ثم تمسح.
8. الأكواب وأدوات الشطف بالماء الدافئ ومعلقة على الرف حتى يجف (وصمة عار قبالة الصكوك حتى لا الصدأ).
9. التخلص من النفايات تطهير اسفل الحوض.
10. عودة إلى البراد وسائط غير مستخدمة.
11. التخلص من النفايات في قفازات واقية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Collagenase			10 mL per cord, warmed to 37 °C
Tissue culture flasks			T75, one per cord.
Hanks medium
scissors			sterile
beaker			sterile
50 mL tubes