ヒト臍帯静脈内皮細胞の単離（HUVEC）

要約

このビデオプロトコルは、ヒト臍帯からヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）の単離と文化を示しています。一旦単離さこれらの細胞はまた、ヒューズの研究室で実証最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイなどのin vitroでの血管新生アッセイに使用することができます。

要約

血管新生は血管新生の刺激に応答して、新しい血管が既存の血管系から作成される複雑なマルチステップのプロセスです。これらの手順は、次のとおりコード、管腔形成、吻合、および新たな基底膜の形成に細胞外マトリックス、ECの整列への内皮細胞の基底膜、増殖と移動（萌芽）（EC）の低下。 in vitroアッセイの多くは、このプロセスを研究するために開発が、ほとんど唯一の血管新生の特定の段階を模倣し、形態学的に血管が多くの場合、in vivoで血管似ていないされています。ここでは、ヒト臍帯静脈ECと線維芽細胞を利用したin vitroでの血管新生アッセイに最適化を示しています。このモデルは、反復する血管新生の重要な初期段階のすべてを、そして重要な血管が偏ECに囲まれた特許細胞間ルーメンを表示します。血管は容易に位相コントラストとタイムラプス顕微鏡で観察し、下流のアプリケーション用に純粋な形で回収することができます。

プロトコル

手順

1. 過剰な血液オフクリーンパッドとDABにコードを置く。コー​​ドの両端で新鮮なカットを行います。
2. 静脈に、ONプラスチック針のシースで21 1 / 2 Gの針を挿入します 。 （静脈の最大の開口部である、2小さいものが動脈です。）
3. 止血剤で固定針をクランプし、針にハンクスの20ccシリンジを取り付けます。
4. 適度な圧力で静脈を通してハンクスを押してください 。漂白剤とビーカー内で廃棄物を収集する。 （押しながら片手で針とコードを保持する静脈から飛び出る針を妨げる。）静脈内の血液の多くがある場合は、もう一度洗う。
5. パッドの上にコードを置くと静脈のもう一方の端をクランプ。脊髄に沿ってリークをチェックするハンクスの数mLで埋める。 5 mLを撤回し、底部のクランプを外してください。
6. 20ccシリンジを外します。 10ccのシリンジからプランジャーを外します。 10mlのコラゲナーゼを投入し、プランジャーを交換、針に10ccの注射器を取り付けます。あなたが開放端を終了する最初の量が表示されるまで、静脈内にコラゲナーゼを押し込みます。開放端を再度クランプし、 静脈の中程度の膨満があるまでコラゲナーゼを詰めます。平滑筋の汚染でも多くの膨満結果。
7. 軽くコードをマッサージ 。
8. 37 DPBSでインキュベートするコード（接続されている止血、注射針や注射器付き）℃で15分間。
9. インキュベートしながら、第^2のコードと手順1-8を続ける。
10. インキュベーション後、50mLのチューブを介して電源コードを保持しながらビーカーからコードを取り出しては、ボトムクランプ上記の端をカット。 チューブ内のすべてのものを収集してください 。コー​​ドを通して、残りのコラゲナーゼを押し、その後20ccシリンジを接続し、適度な圧力で通過ハンクスを押してください。
11. は平滑筋細胞が必要とされていない場合、この時点でコードを破棄。それ以外の場合、37℃〜5ミリリットルコラゲナーゼとインキュベートで2 50mLのチューブに同じコードを配置° Cを30〜60分間。
12. すべてのコードが終了するまでチューブを保管してください。
13. 5分間〜1200 rpmでチューブを回転させる 。
14. 上清を吸引しますが（1〜2 mLを除く）。T25で5mls PHECの+とプレートでペレットを再懸濁します 。
15. ° Cで5％CO ₂で一晩37℃でインキュベートする 。
16. 翌日上清を除去し、新鮮な培地と交換してください。多くの赤血球がある場合は、M199で一度洗い、その後PHEC +を追加。プレートはコンフルエントになるまで（1-4日）いつものようにインキュベートし続ける。糊化T75に分割。
17. 一度T75は3つのT75sに分割、合流です。フラスコごとに2つのバイアルを凍結する。

注：内皮細胞（不活性）石畳の外観を持っている。のカップルは、彼らが通常unactive状態に戻す通過した後に内皮細胞は時々 、右の分離後（長くて先のとがった）活性化される。

クリーン

1. 非常に慎重に、鋭利物容器の中に針を処分する。
2. ビッグバイオハザード容器に注射器を廃棄してください。
3. 小さなバイオハザードバッグにすべての組織を置く。 -20閉じる袋と凍結°焼却時まで。
4. 少なくとも10分間ヴァイラサイドゥですべての楽器を浸す。
5. 廃棄物/漂白剤をビーカーにインキュベーションのメディアを追加します。少なくとも10分間放置します。
6. バイオハザード廃棄物にベンチパッドを捨てる。
7. ビーカー、ベンチトップとvircideで水浴の蓋の内側と外側を下にスプレーしてください。 10分を座らせて、その後拭いてください。
8. 暖かい水でビーカーや楽器をすすぎ、（彼らが錆びていないので、楽器をオフブロット）乾燥してラックにハングアップする。
9. シンク下除染廃棄物を処分。
10. 冷蔵庫に未使用のメディアを返します。
11. バイオハザード廃棄物の手袋を廃棄してください。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Collagenase			10 mL per cord, warmed to 37 °C
Tissue culture flasks			T75, one per cord.
Hanks medium
scissors			sterile
beaker			sterile
50 mL tubes