Isolamento de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC)

Resumo

Este protocolo de vídeo ilustra o isolamento e cultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) de cordão umbilical humano. Uma vez isolados essas células podem ser usadas em ensaios de angiogênese in vitro como o Gel de fibrina Optimized Bead Assay também demonstrada pelo laboratório Hughes.

Resumo

A angiogênese é um processo de várias etapas complexas, onde, em resposta a estímulos angiogênicos, novos vasos são criados a partir da vasculatura existente. Estes passos incluem: degradação da membrana basal a proliferação e migração (sprouting) das células endoteliais (CE) na matriz extracelular, o alinhamento da CE em cordas, formação de lúmen, a anastomose, e formação de uma nova membrana basal. Muitos ensaios in vitro têm sido desenvolvidos para estudar este processo, mas a maioria apenas imitar determinadas fases da angiogênese, e morfologicamente os vasos muitas vezes não se assemelham a vasos in vivo. Aqui demonstramos um otimizado ensaio in vitro que utiliza a angiogênese umbilical humano veia CE e fibroblastos. Este modelo recapitula todas as etapas chave no início da angiogênese, e mais importante dos vasos mostrar lumens patente intercelular cercado por CE polarizada. Vasos podem ser facilmente observados por contraste de fase e microscopia de lapso de tempo, e recuperados em forma pura para aplicações a jusante.

Protocolo

Procedimento

1. Lay cabo na almofada limpa e dab off excesso de sangue. Fazer cortes frescos em ambas as extremidades do cabo.
2. Inserir 21 1 / 2 G agulha com a bainha da agulha de plástico ON, na veia. (A veia é a maior abertura; os 2 menores são artérias)
3. Fixar a agulha no lugar com uma pinça hemostática e anexar a seringa 20cc de Hanks para a agulha.
4. Empurre a Hanks através da veia com pressão moderada. Recolher os resíduos no recipiente com água sanitária. (Segurando a agulha e cordão com uma mão enquanto empurrando impediria a agulha pulando para fora da veia.) Se há um monte de sangue na veia, lave pela segunda vez.
5. Lay cabo na almofada e prenda a outra extremidade da veia. Preencher com alguns ml de Hanks para verificar vazamentos ao longo da medula. Retirar a 5 mL e desconecte o grampo inferior.
6. Desconectar a seringa de 20cc. Retire o êmbolo da seringa 10cc. Anexar seringa 10cc a agulha, despeje 10ml colagenase e substituir êmbolo. Empurre colagenase na veia até ver o primeiro montante sair da extremidade aberta. Re-fixação da extremidade aberta e encha com colagenase até que haja distensão moderada da veia. Demais resultados distensão na contaminação do músculo liso.
7. Massagem suavemente o cabo.
8. Cabo de incubar (com hemostats agulha e seringa em anexo) em DPBS a 37 ° C por 15 min.
9. Durante a incubação, continue os passos 1-8 com 2 ^nd cabo.
10. Após a incubação, tomar cabo de fora do copo e, segurando o cabo de cima do tubo de 50 mL corte a extremidade acima do grampo inferior. Certifique-se de coletar tudo no tubo. Empurre a colagenase restantes através do cordão, em seguida, anexar a seringa 20cc e empurre Hanks completamente com pressão moderada.
11. Se não houver células musculares lisas são necessários, descartar o cabo neste momento. Caso contrário, o cabo do mesmo em um tubo de 50 mL em segundo lugar com 5ml ~ colagenase e incubar a 37 ° C por 30-60 min.
12. Manter o tubo até que todos os cabos são feitos.
13. Girar tubos em ~ 1200 rpm por 5 min.
14. Aspirar o sobrenadante (exceto para ~ mL 1-2). Ressuspender o sedimento em 5mls PHEC + e placa em um T25.
15. Incubar a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante a noite.
16. No dia seguinte remova o sobrenadante e substituir com a mídia fresco. Se houver muitas hemácias, lave uma vez com M199, em seguida, adicione + PHEC. Continue incubação, como de costume até que a placa é confluente (1-4 dias). Dividida em uma T75 gelatinizado.
17. Uma vez T75 é confluente, dividida em três T75s. Congelar dois frascos por frasco.

Nota: As células endoteliais (unactivated) têm uma aparência de paralelepípedo. Células endoteliais são ativados por vezes (longo e pontudo), logo após o isolamento, depois de alguns passes que eles geralmente voltam para um estado unactive.

Limpeza

1. Com muito cuidado, descarte de agulhas em recipiente adequado.
2. Dispor de seringas em recipiente biohazard grande.
3. Colocar todo o tecido em saco biohazard pequeno. Saco de fechar e congelar a -20 ° até a incineração.
4. Mergulhe todos os instrumentos em virucide por pelo menos 10 min.
5. Adicionar meio de incubação para resíduos copo / água sanitária. Deixe descansar por pelo menos 10 min.
6. Descarte as pastilhas de bancada para resíduos de risco biológico.
7. Spray para baixo o interior eo exterior de copos, bancada de trabalho e do banho de água com tampa vircide. Deixe descansar 10 min, em seguida, limpe.
8. Enxágüe copos e instrumentos com água morna e pendurar na cremalheira para secar (blot fora os instrumentos para que eles não ferrugem).
9. Descarte de resíduos descontaminados na pia.
10. Retorno de mídia não utilizados para geladeira.
11. Dispor de luvas em resíduos de risco biológico.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Collagenase			10 mL per cord, warmed to 37 °C
Tissue culture flasks			T75, one per cord.
Hanks medium
scissors			sterile
beaker			sterile
50 mL tubes