בידוד של האדם תאים עורק טבורי האנדותל (HUVEC)

Summary

זה פרוטוקול וידאו ממחישה את הבידוד של התרבות האנושית וריד הטבור בתאי האנדותל (HUVEC) מ חבל הטבור האדם. לאחר מבודד את התאים האלה יכול לשמש ב מבחני חוץ גופית אנגיוגנזה כמו Assay אופטימליים הפיברין ביד ג'ל הוכיח גם על ידי המעבדה יוז.

Abstract

אנגיוגנזה היא תהליך מורכב רב שלבי, שבו בתגובה לגירויים angiogenic, כלי חדש נוצרות vasculature הקיים. צעדים אלה כוללים: ירידה של התפשטות קרום, מרתף והגירה (נביטה) של בתאי האנדותל (EC) לתוך המטריצה ​​תאיים, יישור של EC לתוך מיתרי, היווצרות לומן, השקה, ועל היווצרות קרום מרתף חדשה. רבים מבחני חוץ גופית פותחו כדי ללמוד את התהליך הזה, אבל רוב לחקות רק בשלבים מסוימים של אנגיוגנזה, ואת מורפולוגית כלי לעתים קרובות לא דומים כלי in vivo. כאן אנו מדגימים אופטימיזציה assay אנגיוגנזה במבחנה אשר מנצל האדם וריד הטבור EC ו fibroblasts. זה המודל משחזר את כל השלבים המוקדמים המפתח של אנגיוגנזה, ואת כלי חשוב להציג לומן פטנט אינטר מוקף EC מקוטב. כלי ניתן להבחין בקלות לעומת שלב ואת זמן לשגות מיקרוסקופ, והחלים בצורה הטהורה עבור יישומים במורד הזרם.

Protocol

נוהל

1. הנח חוט על משטח נקי טיפה את הדם העודף. לבצע חתכים טריים על שני קצוות של חוט.
2. הוספת 21 02/01 מחט G עם נדן את המחט הפלסטיק, לתוך הווריד. (וריד היא הפתיחה הגדולה ביותר; 2 הקטנים הם העורקים)
3. הצמד את המחט במקום עם hemostat ולצרף את המזרק 20cc של הנקס אל המחט.
4. דחוף את הנקס דרך הווריד עם לחץ מתון. איסוף הפסולת בתוך כוס עם אקונומיקה. (מחזיק את המחט בחוט ביד אחת בזמן דוחפים ימנע את המחט קופצים מתוך הווריד.) אם יש הרבה דם בווריד, לשטוף בפעם השנייה.
5. הנח חוט על משטח לצבוט את הקצה השני של הווריד. מלאו מ"ל כמה הנקס כדי לבדוק דליפות לאורך חוט. למשוך את 5 מ"ל ונתק את מהדק התחתונה.
6. נתק את מזרק 20cc. הסר את הבוכנה של המזרק 10cc. צרף מזרק 10cc אל המחט, לשפוך 10 מ"ל collagenase ולהחליף הבוכנה. Push collagenase לווריד עד שתראה את כמות first לצאת את הקצה הפתוח. Re-לצבוט את הקצה הפתוח ולמלא עם collagenase עד בינוני יש התנפחות של וריד. התנפחות תוצאות יותר מדי זיהום שריר חלק.
7. עיסוי חוט בעדינות.
8. כבל דגירה (עם מחט, מזרק hemostats ו המצורפת) ב DPBS על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
9. בעוד דוגרים, המשך צעדים 1-8 עם כבל 2 ^nd.
10. לאחר דגירה, לקחת חוט מתוך כוס ובעוד מחזיק את כבל על צינור 50 מ"ל לחתוך את הקצה התחתון מעל מהדק. הקפד לגבות כל הצינור. לחצו על collagenase הנותרים באמצעות כבל, ולאחר מכן לצרף את המזרק 20cc ולדחוף הנקס דרך עם לחץ מתון.
11. אם לא בתאי שריר חלק יש צורך, לזרוק את כבל בשלב זה. אחרת, מקום את כבל אותו לתוך שפופרת 50 מ"ל השני עם collagenase ~ דגירה 5 מ"ל ו - ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות.
12. שמור את הצינור עד שכל כבלי נעשים.
13. ספין צינורות ב 1200 סל"ד ~ 5 דקות.
14. לשאוב supernatant (למעט מ"ל 1-2 ~). Resuspend גלולה ב 5mls PHEC + ו צלחת T25.
15. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ לילה.
16. למחרת supernatant להסיר ולהחליף עם מדיה חדשה. אם יש RBCs רבים, לשטוף פעם עם M199, ולאחר מכן להוסיף + PHEC. המשך דוגרים כרגיל עד צלחת הוא ומחוברות (1-4 ימים). פיצול לתוך T75 gelatinized.
17. לאחר T75 הוא ומחוברות, מפוצל לשלושה T75s. הקפאת שתי צנצנות לכל בקבוק.

הערה: לתאי אנדותל (לא ממושכת) יש מראה המרוצף. בתאי האנדותל מופעלים לעתים (ארוך מחודד) מיד לאחר הבידוד, לאחר כמה עובר הם בדרך כלל לחזור למצב unactive.

ניקוי

1. בזהירות רבה, תשליך מחטים במיכל החדים.
2. השלך מזרקים במיכל Biohazard גדול.
3. מכניסים את כל רקמת לשקית Biohazard קטן. תיק הקפאת סגור ב -20 ° עד שריפה.
4. משרים את כל המכשירים virucide דקות לפחות 10.
5. הוסף מדיה הדגירה לבזבז כוס / אקונומיקה. בואו לשבת לפחות 10 דקות.
6. בטל כריות ספסל לתוך פסולת Biohazard.
7. תרסיס את ומחוצה של כוסות, גבי הספסל ואת אמבטיה עם מים מכסה vircide. בואו לשבת 10 דקות, ולאחר מכן לנגב.
8. לשטוף כוסות וכלי עם מים חמים לתלות על מתלה לייבוש (למחוק את המכשירים כך שהם לא חלודה).
9. השליכו פסולת חיטוי לכיור.
10. חזור התקשורת בשימוש למקרר.
11. השלך את הכפפות פסולת Biohazard.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Collagenase			10 mL per cord, warmed to 37 °C
Tissue culture flasks			T75, one per cord.
Hanks medium
scissors			sterile
beaker			sterile
50 mL tubes