تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Summary

وقد أثبتت الطيف الكتلي ليكون أداة قيمة لتحليل البروتين المجمعات الكبيرة. هذا الأسلوب يتيح نظرة ثاقبة لتكوين العمارة ، رياضيات الكيمياء والشاملة متعددة الوحيدات التجمعات. هنا ، وصفنا ، وخطوة بخطوة ، وكيفية إجراء تحليل الطيف الكتلي الهيكلي ، وتوصيف البنى الجزيئات.

Abstract

الخلايا الحية مراقبة وتنظيم العمليات البيولوجية من خلال العمل المنسق لعدد كبير من البروتينات لتجميع أنفسهم في صفيف الحيوية مجمعات متعددة البروتين ، ^1. للحصول على فهم العمليات الميكانيكية الخلوية المختلفة ، لا بد من تحديد بنية البروتين مثل هذه المجمعات ، وتكشف عن كيفية تنظيمها الهيكلي يملي وظيفتها. كثير من جوانب متعددة البروتين المجمعات ، على أية حال ، من الصعب تميز ، نظرا لطبيعتها غير المتجانسة ، والهيكل غير المتماثلة ، وديناميكية. لذا ، ثمة حاجة إلى نهج جديد لدراسة مستويات عال من التنظيم البروتين.

واحدة من أدوات البيولوجيا الهيكلية الناشئة عن تحليل الجزيئات المجمعات هو الطيف الكتلي (MS) ^2-5. هذا الأسلوب يعطي معلومات عن تكوين البروتينات المعقدة ، رياضيات الكيمياء الوحيدات ، والبنية الهيكلية. قوة MS مستمد من حساسية عالية ، ونتيجة لذلك ، شرط العينة المنخفضة ، والتي تمكن من فحص البروتين المجمعات التي أعرب عنها في المستويات المحلية. ميزة أخرى هي سرعة التحليل ، والذي يسمح برصد ردود الفعل في الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك ، يمكن للتقنية قياس الوقت نفسه خصائص السكان منفصلة تتعايش في خليط.

هنا ، نحن تصف بروتوكول مفصلة لتطبيق MS الهيكلي لتحليل البروتين التجمعات الكبيرة. الإجراء يبدأ التحضير من الذهب المطلي الشعيرات الدموية لالتأين electrospray nanoflow (نيسي). ثم واصلت مع إعداد العينات ، والتأكيد على الشروط التي ينبغي أن تكون عازلة متوافق مع نيسي من جهة ، وتمكين للحفاظ على المجمعات سليمة من ناحية أخرى. نفسر ذلك الحين ، خطوة بخطوة ، وكيفية تحسين ظروف تجريبية لقياس كتلة عالية والحصول على الماجستير وجنبا إلى جنب أطياف MS. وأخيرا ، فإننا نرسم معالجة البيانات والتحليلات التي تتبع. بدلا من محاولة كل جانب من جوانب تميز المجالس البروتين ، ويدخل هذا البروتوكول الإجراءات الأساسية MS ، مما يتيح أداء التجارب MS و MS / MS على غير التساهمية المجمعات. عموما ، فإن هدفنا هو تزويد الباحثين غير ملم مع MS مجال الهيكلية ، مع العلم التجريبي من الأدوات الرئيسية.

Protocol

الجزء 1 : إعداد الذهب المطلي الشعيرات الدموية لالتأين electrospray nanoflow

عادة ما يتم إجراء تحليل غير التساهمية المجمعات عن طريق تأين electrospray nanoflow (نيسي) ⁶ ، وذلك باستخدام الزجاج أو الكوارتز الشعيرات الدموية التي تم سحبها إلى الحافة الدقيقة (~ 1 ميكرون القطر الداخلي) ، ومغلفة بمواد موصلة (عادة الذهب) . هذه الشعيرات الدموية المتوفرة من مصادر تجارية (الهدف الجديدة أو Proxeon) جاهزة للاستعمال ، إلا أنه يمكن أن يكون أكثر فعالية من حيث التكلفة لإعدادهم في المنزل :

1. عصا قطعتين من وسادة لاصقة على الوجهين إلى أسفل طبق بيتري ، 2 سم عن بعضها البعض. وضع قضيب من الزجاج (8 سم × 5 ملم) في وسط واحدة من منصات. وسوف تعقد لوحة لاصقة الشعيرات الدموية في مكان ، وقضيب الزجاج ستدعم أعد الشعيرات الدموية ، والحفاظ على نصائح من كسر (الشكل 1).
2. استخدام الزجاج البورسليكات الشعيرات الدموية ، 1.0 مم OD X 0،78 ملم معرف (ونحن استخدام حزم من 500 رقيقة الشعرية البورسليكات الجدار من الآلات وارنر ، القط. لا. G100TF - 4). إدراج أحد الشعرية في مجتذب إبرة (نستخدم النموذج P - 97 من شركة آلات سوتر). المشبك على شعري بلطف في مكان ، وتعديل موقفها بحيث انها تقع في وسط خيوط تسخين مجتذب الإبرة. تشديد المشابك بلطف ، حتى يتم عقد شركة الشعرية عند كلا الطرفين.
3. سحب شعري ، وذلك باستخدام برامج محددة سلفا. وسحبت كل شعري تثير لاثنين من الشعيرات الدموية ، شكل نهائي. عملية البرمجة مجتذب هو واحد من المحاولة والخطأ ، وحتى يتم الحصول على شكل نصيحة مقبولة. نحن نستخدم البرنامج التالي :

   خطوة	حرارة	سحب	Vell	مرة
   1	750	--	15	80
   2	700	--	15	50
   3	750	200	20	80

4. إزالة الشعيرات الدموية وانسحبت من الصك وتفقد نصائح ، ونبذ أي التي تكون مشوهة أو مكسورة. استخدام ملاقط فظة (نستخدمها لتحديد المواقع من ملاقط دقيقة CK) ، لوضع الشعيرات الدموية في طبق بتري. يجب أن يرفق قاعدة الشعرية الى منصة لاصقة والجزء العلوي ينبغي تتكئ على قضيب من الزجاج ، مع التلميح إلى الارتفاع.
5. مرة واحدة في صحن مليء بيتري (حوالي 80 في الشعيرات الدموية تناسب طبق قطره 10 سم) ، تضاف إلى لوحة ذهبية بصق المغطي (نستخدم نموذج رقم EMS550 من EMS). تأكد من أن يتم اختيار امدادات الغاز وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، وتنشيط دورة طلاء مسبقا (أرغون نستخدم الضغط 4 رطل ، تحت ضغط الفراغ 5 × 10 ^-2 ميليبار ، تيار 45mA ، وطلاء من الوقت 1 دقيقة ، ل3-6 دورات ، حتى الشعيرات الدموية هي ذهبية بالتساوي).

الجزء 2 : إعداد نموذج

1. مطلوبة تركيزات منخفضة micromolar من العينة (1 -- 20 ميكرون). إذا لزم الأمر ، والتركيز على عينة باستخدام أجهزة الطرد المركزي الفائق (على سبيل المثال ، Vivaspin من سارتوريوس ، أو NanoSep من شركة بال). فمن المستحسن أن التحقق من الامتزاز من بروتين معقد لغشاء الجهاز قبل الاستخدام.
2. في كثير من الأحيان ، ومخازن تنقية أو حلول التخزين للبروتين معقد غير متوافقة مع نيسي ، والتي يمكن استخدامها سوى حلول المتقلبة. لذا ، من الضروري تبادل العازلة. هذه الخطوة الحاسمة ، التي تتم إزالة كل أثر للأملاح ، والجزيئات عازلة أو أي دولة أخرى غير متقلبة adducts مثل الجلسرين ، DTT ، أو EDTA ، ويحدد نوعية الأطياف. عادة ، يتم استخدام محلول مائي خلات الأمونيوم ، وبتركيز يتراوح بين 5 ملم و M 1 ، وعلى درجة الحموضة 6-8. لا يمكن أن يؤديها العازلة الصرف باستخدام الترشيح هلام العمود microcentrifuge (على سبيل المثال ، مايكرو بيو سبين الأعمدة اللوني 6 من بيو راد). ويمكن تكرار هذه الخطوة 1-3 مرات مع تخفيف الأدنى (أقل من 1.3 عامل لكل جهاز ⁵⁾ ، وحتى يتم تحقيق تبادل القصوى. إذا كان كلاهما مطلوب التركيز وتبادل العازلة ، قد فعلت هذه معا ، وذلك باستخدام الفائق الطرد المركزي (ه ، ز ، Vivaspin من سارتوريوس ، أو NanoSep من شركة بال).

الجزء 3 : معايرة مطياف الكتلة لقياس كتلة عالية

يتم تنفيذ معظم التجارب التي أجريت على بروتين المجمعات متعددة باستخدام electrospray نانو رباعي من مرة والطيران (Q - TOF) الصك. يقترح أن استخدام عامل تصفية الشامل رباعي تعديلها لترددات منخفضة ، لتمكين نقل والتحليل الشامل للأيونات ذات قيم م / ض ارتفاع ^7،8. فمنكما أوصت بأن تضاف مداخل الغاز ^7،8 أو الأكمام ⁹ إلى أداة في دليل ايون الأول ، لتمكين السيطرة على ضغط في مرحلة الفراغ الأول. هذا الأخير تمكن الأمثل للانتقال ، وdesolvation من الأيونات كبيرة جدا ^7-9. حاليا ، ESI - TOF التجارية والصكوك Q - TOF المتوفرة من العديد من الشركات المصنعة (على سبيل المثال ، ووترز ، SCIEX ، بروكر ، أو اجيلنت) والتي يمكن تعديلها بسهولة نسبيا ، وفعالية من حيث التكلفة ، لتطبيقات MS ^7،8 الأصلي. فمن الممكن ، ومع ذلك ، لاستخدام معيار TOF أو تكوينات QToF على صكوك مثل LCT أو QToF1 (مياه) للحصول على الأطياف الشامل للمجمعات تصل إلى 1 نجمة داود الحمراء ، من دون الحاجة إلى إدخال تعديلات الأجهزة ^5.

وقد أجريت للبروتوكول المبينة أدناه على صك Synapt (مياه).

1. إعداد 100 ملغ / مل حل منظمة التضامن المسيحي الدولية في تنقية المياه. وتستخدم منظمة التضامن المسيحي الدولية للمعايرة الكتلة عالية مثل كتل الملح اتهم منفردة ، (CSI) _ن ⁺ جيم تمتد على نطاق واسع شامل ، في الفترة من 393 م / ض إلى ما يزيد عن 10000 (الشكل 2).
2. باستخدام الملقط حادة ، واتخاذ الشعرية المغلفة من طبق بيتري و2μL حمولة من الحل منظمة التضامن المسيحي الدولية في شعري ، وذلك باستخدام تلميح GeLoader إيبندورف.
3. تضاف الشعرية في حامل الشعرية ، وضبط الشعرية في مثل هذه الطريقة التي هي غيض حوالي 10 ملم بعيدا عن حافة حامل.
4. الشريحة الحل نحو غيض من الشعرية إما يدويا أو باستخدام محول تدور باستمرار.
5. ضع الشعرية تحت المجهر الضوئي وتقليم الطرف ، وذلك باستخدام نوع AA - حادة ملاقط.
6. توصيل حامل الشعرية إلى واجهة nanoflow ES. تدوير المرحلة XYZ إلى الوراء لتجنب إتلاف الشعرية ، ودفع إلى مرحلة موقفها تفعيلها. وينبغي أن توضع الشعرية 1-10 مم من فوهة المخروط.
7. تطبيق الجهد الشعري (1050-1400 V) ، وانخفاض ضغط nanoflow (0،00-0،03 بار) حتى يبدأ الرش ، ثم حاول التقليل من الضغوط nanoflow إلى قيمة الحد الأدنى.
8. تحسين كثافة إشارة عن طريق ضبط موقع XYZ المرحلة ، الجهد الشعري ، والضغط nanoflow ، وتدفق الغاز desolvation.
9. للكشف عن مجموعة واسعة من كتلة ذروة سلسلة CSI ، ينبغي أن يكون الأمثل للتعجيل الفولتية (نستخدم المعايير التالية : شعري 1،3-1،7 كيلوفولت ، مخروط عينة 80 - 150V ، واستخراج مخروط 1-3 الخامس).
10. لتحسين انتقال الأيونات الشامل عالية ، والتي تتطلب ظروف desolvation لطيف ، بدعم من الضغوط في المرحلة الأولي الفراغ ، بين المصدر ومحلل وينبغي أن تثار. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق خفض بعناية تصرف النظر عن مصدر خط فراغ إلى المضخة التمرير ، جزئيا عن طريق إغلاق صمام العزل (SpeediValve). من أجل تحديد وجهة مثلى ، ينبغي أن يتم هذا الأخير في حين رصد تأثير على كثافة إشارة (التي نستخدمها عادة 3،0-6،5 ميللي بار).
11. جمع نحو 30 في 1 بمسح تفحص / ثانية ، في نطاق م / ض ما بين 1000 إلى 15000 م / ز.
12. بعد الاستحواذ ، معايرة TOF باستخدام الجدول المعايرة المناسبة.

الجزء 4 : MS تحليل مجمعات البروتين سليمة

1. تحميل العينة ، كما هو موضح (الجزء 3 ، مقاطع 2-5) ، والشروع في الرش.
2. تبدأ التحسين الأولية للرذاذ (الجزء 3 ، قسم 6-9) ، حتى يتم الكشف عن الإشارة. الموضع الدقيق للدول التهمة هي التي تعتمد على البروتين ، ولكن يمكن التنبؤ به ، باستخدام العلاقة بين الكتلة ومتوسط ​​أيون الدولة المسؤول ، على النحو التالي : (Z AV) ¹⁰ : _AV Z = 0.0778 √ (م) ، الذي م كتلة المجمع في دالتون. لمنع تفكك معقدة ، لا مصدر الحرارة ايون : إما تبديل قبالة المدفأة ، أو الحفاظ على درجة حرارة أقل من 40 درجة مئوية.
3. يختلف الموقف الشعري ، مخروط العينة والفولتية مستخرج لتعظيم نقل أيون ، والتحقق من التغيير في الناتج الأطياف. ويمكن أن يكون نقطة انطلاق محتملة مخروط الجهد 100 فولت ؛ مستخرج المخروط : 1 الخامس ؛ الجهد الشعرية 1،5 كيلو فولت. تحسين هذه المعايير ، في تركيبة مع الضغط nanoflow.
4. لتحسين desolvation وتجريدها من المياه المتبقية ومكونات عازلة ، وزيادة الجهد التحيز وضغط الغاز في الخلية الاصطدام. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بعناية ، لمنع تفكك المجمع. الفولتية التحيز النموذجية هي ضمن مجموعة من 1-10 V ، مع اعتراض تدفق الغاز من 10-10 مل / دقيقة (الشكل 3). قد التكيف دليل الإعداد والتعريف RF رباعي تحسين انتقال الأيونات الشامل عالية.
5. ضبط فخ الاصطدام وطاقات النقل. في كثير من الأحيان ، هناك حاجة لزيادة الفولتية انتقال الأيونات الشامل عالية (عادة ضمن نطاق 10-30 الخامس). عند هذه النقطة ، فمن المهم لتجنب الاصطدام الناجم عن تفكك المجمع.
6. بعد إشارة غير مستقرة صeached ، فمن المستحسن أن يتم تخفيض الضغط والجهد nanoflow الشعرية إلى قيم الحد الأدنى ، مع الحفاظ على رش مستقرة.

الجزء 5 : جنبا الى جنب مطياف الكتلة : مجمعات البروتين النأي

1. مرة واحدة وقد تم الحصول على إشارة الأمثل ومستقر ، حدد ايون السلائف. تعيين مركز الشامل والعرض العزلة (التي نستخدمها عموما قرار LM ال 12 ، وقرار جلالة تتراوح بين 13 و 15). استخدام نطاق واسع شامل للكشف عن كتلة عالية / منخفضة تهمة المنتجات التفكك. فمن المستحسن أن تقوم بتعيين مجموعة م / ي إلى المستوى الأقصى ، وخفض بعد ذلك إلى القيم المرغوبة. نحن نقترح المزيد من MS superimposing والأطياف MS / MS ، للتحقق من صحة عزلة ايون السلائف الذي تم اختياره.
2. لأداء MS / MS ، تنأى أيون السلائف عن طريق زيادة طاقة التصادم (CE) والضغط على الخلية على الاصطدام. إما زيادة أو مصيدة نقل CE تدريجيا ، في خطوات 20V - 10 ، ورفع ضغط الغاز لاصطدام 0-5 مل / دقيقة (القيم المشتركة). تم التوصل إلى رصد التغيرات في الظروف حتى الأطياف تفعيل الأمثل. ارتفاع طاقة التنشيط قد حث تفارق واحد أو أكثر من مفارز مجمع سليمة ، وتوضيح الانتماءات تفاعل مفارز مختلفة. نحن عادة استخدام غاز الارجون والتصادم في خلايا فخ / نقل ، وإن كانت قد ذكرت فوائد استخدام الغاز أثقل (مثل إكس إي أو SF ₆₎ ، ولكن هذه الغازات هي أكثر تكلفة بكثير ¹¹ (الشكل 3).
3. فمن المستحسن أن يتم اختيار اكثر من دولة واحدة عن تهمة MS / MS التحليل. في حالة مكونات متداخلة ، سوف اكتساب مجموعة من جنبا إلى جنب أطياف MS مساعدة في حل سلسلة من تهمة السكان المختلفة. وعلاوة على ذلك ، فإن الدول أعلى تهمة فصل بسهولة أكبر ، مقارنة مع دول أقل تهمة ^12.
4. بالإضافة إلى توصيف لمجمع سليمة ، ويقترح أن يتم إنشاء أصغر subcomplexes في الحل ، في ظل ظروف تغيير طبيعة معتدلة. التحليلات MS و MS / MS من subcomplexes تشكل أساسا لتحديد بنية الوحيدات من ¹³ معقدة. لانقطاع جزئي لالوحيدات وحدة فرعية من التفاعلات ، وإضافة تدريجيا المذيبات العضوية (مثل الميثانول ، والأيزوبروبانول ، أو أسيتونتريل) الى تركيز 50 ٪ ، أو تغيير الرقم الهيدروجيني من الحل بإضافة الأمونيا أو حمض الفورميك (إلى تركيز من 4 ٪).
5. لتحديد جماهير مفارز الفردية التي تؤلف المجمع ، فمن المهم للحصول على الطيف في ظل ظروف تغيير طبيعة. ويمكن أن يتم ذلك باستخدام الرمز C - تلميح ₄ (ميليبور) مع نسبة الماء / 25:75 أسيتونتريل ، مع حمض الفورميك بنسبة 1 ٪ كما شطف المذيبات.

الجزء 6 : معالجة البيانات وتحليلها

1. ويتم تحليل البيانات حاليا ، وذلك باستخدام برامج التحليل الطيفي لأطياف MS. نحن عادة استخدام برنامج MassLynx (مياه).
2. الأطياف التي تمتد لمجموعة واسعة م / ض النطاق ، فإننا نوصي بأن يتم تطبيق مخططات مختلفة من تجانس والمعلمات النقطه الوسطى للمناطق م / ض العالية والمنخفضة ، لتعكس الاختلاف في القرار ذروة هذه المناطق.
3. لتحديد سلسلة تهمة وتهمة حساب الدول والجماهير ، "دليل العثور على" يمكن تطبيقها على وظيفة MassLynx. في الحالات المعقدة من الأطياف الشامل مع مكونات متداخلة ، قد الحساب اليدوي من الجماهير أن تكون أكثر سهولة.
4. لتسهيل هذه العمليات الاحالة ، يمكن استخدام برامج إضافية ، على سبيل المثال : لMaxEnt deconvolution الأطياف ¹⁴ SOMMS لتركب الذروة والمحاكاة ¹⁵ ، ومؤتمر القمة العالمي للتكوين وتعيين رياضيات الكيمياء subcomplexes من البروتين وشبكات توليد التفاعل البروتين ^13،16،17 .

الجزء 7 : النتائج الممثل

الشكل 1. إعداد الذهب المغلفة نانو electrospray الشعيرات الدموية.
ألف إرفاق قطعتين لاصقة على الوجهين لطبق بيتري ، 2 سم عن بعضها البعض. لدعم إعداد الشعيرات الدموية ، وضع قضيب من الزجاج (8 سم × 5 ملم) في وسط واحدة من منصات. باء عصا نهاية حادة من الشعيرات الدموية على استعداد للوح اللصق ، وتتكئ على طرف قضيب الزجاج. جيم بمجرد امتلاء طبق بيتري مع الشعيرات الدموية على استعداد ، ومعطف لهم الذهب حتى يترسب بالتساوي طبقة رقيقة من الذهب على السطح الخارجي من الشعيرات الدموية.

الشكل 2. ارتفاع معايرة الكتلة باستخدام أيونات يوديد السيزيوم.
جعلت من مجموعات كبيرة من منظمة التضامن المسيحي الدولية وmonisotopic أنه مجمع خيار لمعايرة الطيف الكتلي لتحليل شامل عالية. سلسلة من القمم على فترات متساوية تمتد على نطاق واسع ، من ض / م 393 الى ما يزيد عن 10،000. هم assigواتهم نيد منفردة كتل الملح لتكوين عامة (CSI) _ن ⁺ CS. هي سبب إشارات إضافية بين قمم رئيسية عن الأنواع المزدوج والثلاثي ، اتهم من سلسلة ؛ [(CSI) _ن CS2] ^{2 +} و [(CSI) _ن CS3] ^{3 +} ، على التوالي. زيادة الضغط في مرحلة فراغ الأولية أمر ضروري للكشف عن مجموعات الشامل عالية. ويتجلى تأثير الضغوط على القمم العالية في لوحات جماعية A. وباء. مع readbacks ضغط 1.2 و 5.3 على التوالي. C. توسيع نطاق الطيف الكتلي معروضة في باء.

الشكل 3. Nanoflow أطياف الشامل electrospray من lectin pentameric.
ألف قياس الطيف الكتلي مجمع متغير lectin (مشتقة من B7 - Lib1 التطور الموجه من قبل ¹⁸⁾ إلى نشوء حالة التوزيعات رسوما تتراوح بين 3000 و 5000 م / ض ، ولكن نظرا لعدم كفاية desolvation من الأيونات ، والقمم واسعة. المقارنة بين ألف وباء لوحة إظهار تأثير زيادة الجهد التحيز من 4V (A) ل15V (B) على عرض الذروة. هذه الزيادة المتسارعة في ظروف أسباب تجريد من المياه المتبقية ومكونات العازلة ، مما أسفر عن حل طيف للغاية. قياس كتلة (60240 ± 38 دا) يناظر مجمع pentameric جيم ثم تم اختيار الدولة المسؤول عن بالترادف +15 MS تحليل (مظللة باللون الرمادي في لوحة ب.) D. الزيادة في الطاقة الاصطدام يؤدي الافراج عن مونومر مشحونة ، تمحورت في 1664 م / ض ، ومجمع جردت رباعي القسيمات ، في حدود 5000 -- 8000 م / ز. تم الحصول على جميع الأطياف من عينة تحتوي على 20 ميكرومتر من الحل في خلات الأمونيوم 0.5M.

Discussion

وينبغي أن تعطى للحصول على الأطياف عالية الجودة الاهتمام للخطوات إعداد العينات ، والتي تتضمن تركيز العينة وتبادل العازلة. وسوف أكثر من عينات العائد المخفف اشارة منخفضة ، في حين عينات عالية التركيز ويمكن لزجة نوعا ما ، وكتلة الإبرة electrospray. وعلاوة على ذلك ، والمضافات حل مثل الأملاح ، والجلسرين والمنظفات الصناعية وايونات المعادن ، والحد من وكلاء (DTT أو β المركابتويثانول) ، وتميل إلى الانضمام إلى السطح الخارجي للبروتينات ، وتتسبب في توسيع نطاق القمم. ولذلك ، من أجل تحقيق حل جيدا قمم ، ينبغي أن تضاف هذه المكونات عند أدنى تركيز ممكن.

معلمة أخرى المفتاح هو موقف nanoflow الشعرية ، نسبة إلى فوهة مطياف الكتلة. قد العثور على "بقعة الحلو" يمكن أن يكون تحديا للمستخدمين عديمي الخبرة ، ومع ذلك ، فإنه يؤثر بشكل كبير على نوعية الأطياف. من المهم أيضا النظر في nanoflow الشعرية قبل الشروع في الرش. حجم القطيرات هي وظيفة من قطر الحافة ، التي ينبغي أن تكون 1μm ~. قطرات صغيرة تؤدي إلى تأين أكثر كفاءة ، وبالتالي سيكون من المفيد. من المهم أيضا للتحقق من عدم وجود فقاعات هواء داخل الشعيرات الدموية التي يمكن ان تمنع تدفق ، والتي لم يتم تجريد طلاء الذهب من خلال اقتناء الشعرية ، وإذا كان الأمر كذلك ، خفض المزيد من الحافة. نضع في اعتبارنا أن كمية زائدة من عينة سيزيد من امكانية تحسين ظروف MS مثل الجهد الشعري ، الفولتية تسريع والضغط والطاقة الاصطدام.

عموما ، لقد تم استخدام الإجراءات التي شرحها في بروتوكول لتحديد التركيب ، رياضيات الكيمياء والهندسة المعمارية من البروتين العديد من المجمعات (انظر استعراض 2،3،4). تحليل المجمعات الكبيرة مثل نجمة داود الحمراء في ¹⁹ الريبوسوم وcapsids الفيروس أمر غاية ^20-22 ، في تحديد ملزم لالركيزة آلات جزيئية ^23-25 ​​، أو توصيف شبكات التفاعل الوحيدات بمثابة ^{26،17،16،17،27،28} لكن بضعة أمثلة من قيمة هذا النهج.

Materials

عينة	مطلب	تعليقات
حجم	1-2 ميكرولتر	في شعري
تركيز	1 - 20μM	في مجمع
العازلة	Aquanos العازلة المتطايرة مثل خلات الأمونيوم عند pH = 6-8	عادة 5 ملم 1M
منظف	أدنى	مجموعات من الجزيئات تنتج المنظفات قمم واسعة والتي لم تحل
الغليسيرول	الحد الأدنى (حتى 5 ٪)	تلتزم nonspecifically للبروتينات ، وبالتالي لوحظ قمم واسعة
المذيبات العضوية	تصل إلى 50 ٪	قد تفسد البروتينات المجمعات
الأحماض	تصل إلى 4 ٪	مجمعات البروتين تفسد
أملاح	أدنى	adducts الملح يؤدي الى قمم واسعة النطاق والتي لم تحل
DTT	أدنى	1-2 ميكرومتر يمكن أن تكون موجودة
عوامل مخلبية	أدنى	أكثر من 250 ميكرومتر يؤدي إلى تشكيل واسعة النطاق ناتج إضافة