ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Summary

ספקטרומטריית מסה הוכיחה להיות כלי רב ערך עבור ניתוח מערכות חלבון גדול. שיטה זו מאפשרת תובנות אדריכלות, הרכב stoichiometry הכוללת של למקטע רב מכלולים. כאן, אנו לתאר, שלב אחר שלב, כיצד לבצע ניתוח מבניות ספקטרומטריית מסה, ולאפיין מבנים macromolecular.

Abstract

תאים חיים מלאה לווסת את התהליכים הביולוגיים שלהם באמצעות פעולה מתואמת של מספר רב של חלבונים להרכיב את עצמם לתוך מערך דינמי, חלבון רב מתחמי ^1. כדי להשיג הבנה מכניסטית של תהליכים תאיים שונים, חשוב לקבוע את המבנה של קומפלקסים חלבונים כאלה, חושפים כיצד ארגון המבני שלהם מכתיב את תפקידם. היבטים רבים של חלבון רב קומפלקסים, עם זאת, קשה לאפיין, בשל אופי הטרוגני שלהם, מבנה אסימטרי, ואת הדינמיקה. לכן, גישות חדשות נדרשות ללימוד ברמות שלישוני של הארגון חלבון.

אחד הכלים המתפתחים הביולוגיה המבנית לניתוח מתחמי macromolecular הוא ספקטרומטריית מסה (MS) ^2-5. שיטה זו מניבה מידע על הרכב החלבון מורכב, stoichiometry למקטע, ועל טופולוגיה מבניים. כוחה של MS נובעת הרגישות הגבוהה שלה, כמו דרישה, תוצאה מדגם נמוך, המאפשר בחינה של קומפלקסים חלבונים לידי ביטוי ברמות אנדוגני. יתרון נוסף הוא מהירות של ניתוח, המאפשר ניטור של תגובות בזמן אמת. יתר על כן, הטכניקה יכולה בעת ובעונה אחת למדוד את המאפיינים של אוכלוסיות נפרדות שיתוף הקיים בתערובת.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור היישום של MS מבניים ניתוח של מכלולים חלבון גדול. ההליך מתחיל עם הכנת מצופה זהב נימים עבור יינון electrospray nanoflow (nESI). לאחר מכן הוא ממשיך עם הכנת המדגם, תוך שימת דגש על התנאים חיץ אשר אמור להיות תואם nESI מצד אחד, ולאפשר לקיים קומפלקסים שלמים, מצד שני. לאחר מכן, אנו להסביר, צעד אחר צעד, כיצד לייעל את תנאי הניסוי עבור מדידות מסה גבוהה לרכוש MS ו-MS טנדם ספקטרה. לבסוף, אנו בתרשים עיבוד נתונים וניתוחים הבאים. במקום לנסות לאפיין כל היבט של מכלולים חלבון, פרוטוקול זה מציג נהלים בסיסיים של MS, מה שמאפשר ביצוע ניסויים MS ו MS / MS על הלא קוולנטיים קומפלקסים. בסך הכל, המטרה שלנו היא לספק לחוקרים בקיא בתחום MS מבניים, עם הידע של כלי ניסיוני העיקרי.

Protocol

חלק 1: הכנת מצופה זהב נימים עבור יינון electrospray nanoflow

אנליזה של הלא קוולנטיים מתחמי מבוצע בדרך כלל באמצעות יינון electrospray nanoflow (nESI) ^6, באמצעות זכוכית קוורץ או נימים שהיו משך עד קצה קנס (~ 1 מיקרומטר קוטר פנימי), וכן מצופה בחומר מוליך (בדרך כלל זהב) . נימים כאלה זמינים מוכן לשימוש ממקורות מסחריים (מטרה חדשה או Proxeon), אולם זה יכול להיות יותר יעיל וחסכוני להכין אותם בתוך הבית:

1. Stick שתי רצועות של כרית דו צדדית דבק לתחתית צלחת פטרי, 2 ס"מ זה מזה. המקום מוט זכוכית (8 ס"מ x 5 מ"מ) במרכזה של אחת הרפידות. רפידת דבק יחזיק את נימי הדם במקום, ואת מוט זכוכית יתמוך נימים מוכן, לשמור על טיפים לפרוץ (איור 1).
2. השתמש בורוסיליקט זכוכית נימים, 1.0 מ"מ OD x 0.78 מ"מ id (אנו משתמשים באריזות של 500 דק קיר בורוסיליקט נימים של וורנר מכשירים, חתול. לא. G100TF-4). להוסיף אחת לתוך נימי חולץ את המחט (אנו משתמשים במודל P-97 של כלי סאטר ושות'). קלאמפ נימי בעדינות במקום, ולהתאים את עמדתה כך טמון במרכז נימה חימום המחט של חולץ. הדק את מהדק בעדינות, עד נימי נערך המשרד בשני קצותיו.
3. משוך את נימי, באמצעות תוכנית מוגדרת מראש. בכל נימי שלף יהיה להצמיח שני האחרון, נימים בצורת. תהליך התכנות חולץ אחד של ניסוי וטעייה, עד קצה צורה מקובלת מתקבל. אנו משתמשים התוכנית הבאה:

   צעד	חום	משוך	Vell	זמן
   1	750	-	15	80
   2	700	-	15	50
   3	750	200	20	80

4. הסר את הנימים משך מהמכשיר ולבדוק את הטיפים, כל השלכת כי הם מעוותים או שבור. שימוש בוטה פינצטה (פינצטה אנו משתמשים מיצוב מ Precision CK), אל המקום נימים בצלחת פטרי. הבסיס של נימי יש לצרף לרפד את דבק את החלק העליון צריך להישען על מוט הזכוכית, עם קצה כלפי מעלה.
5. לאחר צלחת פטרי מלאה (כ בכושר נימים 80 ס"מ לתוך צלחת בקוטר 10), להכניס את הצלחת לתוך הזהב גמגום coater (אנו משתמשים במודל לא. EMS550, מ EMS). ודא כי אספקת הגז נבחר על פי הוראות היצרן, ולהפעיל מחזור ציפוי מוגדרים מראש (נשתמש בלחץ ארגון 4 psi, בלחץ ואקום של 5 x 10 ^-2 mbar, זרם של 45mA, וזמן ציפוי של 1 דקות, במשך 3-6 מחזורים, עד הנימים הם זהב שווה).

חלק 2: הכנת המדגם

1. ריכוזים נמוכים של מיקרו מדגם נדרשים (1-20 מיקרומטר). אם יש צורך, לרכז את המדגם באמצעות מכשירים ultrafiltration צנטריפוגלי (למשל, Vivaspin מ סארטוריוס, או NanoSep מ מל Corporation). מומלץ לכם לבדוק את ספיחה של המתחם חלבון הממברנה מכשיר, לפני השימוש.
2. לעתים קרובות, מאגרים טיהור או פתרונות אחסון של המתחם חלבון אינם תואמים nESI, אשר רק פתרונות נדיפים ניתן להשתמש. לכן, מטבע חיץ הכרחי. זהו שלב קריטי, שבו כל עקבות של מלחים, מולקולות חיץ או אחרת נדיף adducts כגון גליצרול, DTT, או EDTA מוסרים, קובעת את האיכות של הספקטרום. בדרך כלל, בתמיסה מימית אמוניום אצטט משמש, בריכוז של בין 5 מ"מ ו 1 ז, ו - ב-pH 6-8. מאגר החליפין יכול להתבצע באמצעות ג'ל microcentrifuge סינון עמודה (למשל, מיקרו Bio-Spin 6 עמודות כרומטוגרפיה של Bio-Rad). צעד זה יכול להיות 1-3 פעמים עם דילול מינימלי (פחות מ בפקטור של 1.3 לכל מכשיר ^5), עד חילופי מקסימלית מושגת. אם הן ריכוז חילופי חיץ נדרשים, אלה ניתן לעשות זאת יחד, בעזרת ultrafiltration צנטריפוגלי (ה, ז, Vivaspin מ סארטוריוס, או NanoSep מ מל Corporation).

חלק 3: כיול ספקטרומטר מסה למדידות מסה גבוהה

רוב הניסויים שנערכו על חלבון רב מתחמי מבוצעות באמצעות ננו electrospray quadrupole בזמן של הטיסה (Q-TOF) מכשיר. מומלץ להשתמש במסנן מסה quadrupole מותאם בתדרים נמוכים, כדי לאפשר שידור המוני ניתוח של יונים עם ערכים גבוהים מ / z ^7,8. זהמומלץ גם כי פתחי הכניסה גז ^7,8 או שרוולים ⁹ יתווספו המכשיר במדריך יון הראשון, כדי לאפשר לשלוט בלחץ בשלב ואקום הראשון. זו האחרונה מאפשרת אופטימיזציה של שידור, ואת desolvation של יונים גדולות מאוד ^7-9. נכון לעכשיו, מסחרי ESI-TOF ו-Q-TOF מכשירים זמינים מיצרנים שונים (למשל, ווטרס, SCIEX, Bruker, או Agilent), אשר ניתן לשנות בקלות יחסית וחסכונית, עבור ילידי יישומי MS ^7,8. יתכן, עם זאת, להשתמש תקן תצורות תוף או QToF על מכשירים כגון LCT או QToF1 (ווטרס) לרכישת ספקטרום המונית מתחמי עד 1 מד"א, ללא צורך בשינויים בחומרה ^5.

פרוטוקול המפורטים להלן נערך על מכשיר Synapt (ווטרס).

1. הכן 100 מ"ג / מ"ל ​​פתרון של CSI של מים מטוהרים. CSI משמש לכיול מסה גבוה ככל אשכולות מלח טעונה לחוד, (CSI) _n Cs ⁺ משתרעים על פני מגוון רחב המונית, מתוך 393 מ '/ z אל מעל 10,000 (איור 2).
2. בעזרת פינצטה בוטה, לקחת נימי מצופה מצלחת פטרי 2μL עומס של הפתרון CSI לתוך נימי, באמצעות קצה GeLoader Eppendorf.
3. הכנס את נימי הנימים לתוך מחזיק, ולהתאים את נימי בצורה כזאת, כי הטיפ הוא כ 10 מ"מ מהקצה של בעל.
4. החלק את הפתרון לעבר קצה של נימי באופן ידני, או באמצעות מתאם ספין למטה.
5. מניחים את נימי תחת מיקרוסקופ אופטי לקצץ את קצה, באמצעות חדה AA-סוג פינצטה.
6. חבר בעל נימי לממשק ES nanoflow. סובב את הבמה xyz אחורה כדי למנוע נזק נימי, ולדחוף את הבמה למצב מופעל שלה. נימי יש להציב 1-10 מ"מ מבית פתח את הגביע.
7. החל מתח נימי (1050-1400 V) ולחץ nanoflow נמוכה (0.00-0.03 בר) עד ספריי הוא יזם, ואז לנסות להפחית את הלחץ nanoflow ערך מינימלית.
8. מטב את עוצמת האות על ידי התאמת המיקום של הבמה xyz, מתח נימי, הלחץ nanoflow, ואת זרימת הגז desolvation.
9. כדי לזהות מגוון רחב של המוני שיא בסדרה CSI, מתח מאיץ צריך להיות מותאם (שאנו משתמשים הפרמטרים הבאים: kV נימי 1.3-1.7, חרוט מדגם 80-150V, מיצוי חרוט 1-3 V).
10. כדי לייעל את העברת יונים מסה גבוהה, אשר דורשים תנאים desolvation עדין, הלחץ גיבוי בשלב הראשוני ואקום, בין המקור לבין המנתח, אמור להיות מורם. זו יכולה להיות מושגת על ידי בקפידה הקטנת המוליכות של הקו מקור ואקום כדי לשאוב את המגילה, באופן חלקי על ידי סגירת שסתום בידוד (SpeediValve). על מנת להגדיר את הנקודה האופטימלית, הלה צריך להיעשות תוך מעקב אחר כל השפעה על עוצמת האות (אנחנו בדרך כלל להשתמש 3.0-6.5 mbar).
11. איסוף על 30 סריקות בבית 1 סריקה / sec, מטווח m / z של בין 1,000 ל -15,000 מ '/ z.
12. לאחר הרכישה, לכייל את TOF באמצעות שולחן כיול מתאים.

חלק 4: ניתוח MS של קומפלקסים חלבונים שלמים

1. טען המדגם שלך, כפי שתואר (חלק 3, סעיפים 2-5), וכן ליזום תרסיס.
2. התחל על ידי אופטימיזציה ראשונית של ספריי (חלק 3, סעיפים 6-9), עד האות מזוהה. המיקום המדויק של מדינות תשלום חלבון תלוי, אולם ניתן לחזות, באמצעות היחס בין מסת יון המדינה תשלום ממוצע, כך: (Z av) ^10: Z = 0.0778 _אב √ (מ '), שבו מ הוא מסה של המתחם ב Daltons. כדי למנוע דיסוציאציה מורכבת, לא לחמם את מקור יון: או להחליף את דוד כבוי, או לשמור על טמפרטורה מתחת 40 ° C.
3. שנו את מיקום נימי, חרוט מדגם מתח חולץ על מנת למקסם את העברת יון, ולבדוק את השינוי וכתוצאה מכך הספקטרום. נקודת התחלה אפשרית יכולה להיות חרוט מתח 100 V; חולץ חרוט: 1 V; מתח נימי 1.5 kV. אופטימיזציה של פרמטרים אלו, בשילוב עם הלחץ nanoflow.
4. כדי לשפר את desolvation ופושט את המים שיורית ורכיבים חיץ, להגביר את המתח ההטיה והלחץ גז בתא התנגשות. צעד זה צריך להתבצע בזהירות, כדי למנוע ניתוק של המתחם. מתח הטיה אופייניות הן בטווח של 1-10 V, עם הזרם מלכודת גז של 10-10 מ"ל / דקה (איור 3). התאמה ידנית של הגדרת ה-RF ו פרופיל quadrupole עשוי לשפר את השידור של יונים מסה גבוהה.
5. התאם מלכודת התנגשות העברת אנרגיות. לעיתים קרובות, מתח גבוה נדרשים עבור שידור של יונים מסה גבוהה (בדרך כלל בטווח של 10-30 V). בנקודה זו, חשוב להימנע מהתנגשות-Induced דיסוציאציה של הקומפלקס.
6. אחרי אות יציבה reached, מומלץ כי הלחץ nanoflow מתח נימי להיות ירידה לערכים מינימלית, תוך שמירה על תרסיס יציב.

חלק 5: טנדם ספקטרומטריית מסה: חלבון מתחמי dissociating

1. לאחר אות אופטימלית ויציבה התקבל, בחר יון מבשר. הגדר את מרכז המסה רוחב הבידוד (אנחנו בדרך כלל משתמשים ברזולוציה של LM 12, ופתרון HM של בין 13 ו -15). שימוש במגוון רחב מסה כדי לזהות את המסה גבוה / נמוך תשלום מוצרים דיסוציאציה. מומלץ כי תגדיר את טווח m / z לרמה המקסימלית ולאחר מכן להפחית אותו לערכים הרצויים. בנוסף, אנו מציעים superimposing של MS ו MS / MS ספקטרה, כדי לאמת את הבידוד של יון מבשר הנבחר.
2. כדי לבצע MS / MS, לנתק את יון מבשר על ידי הגברת האנרגיה התנגשות (CE) ואת הלחץ על התא התנגשות. הגדל או מלכודת או העברה לספירה בהדרגה, בצעדים של 10-20V, ולרומם את לחץ הגז התנגשות 0-5 מ"ל / דקה (ערכים משותפים). שינויים צג בספקטרום עד תנאי הפעלה מיטביים הם הגיעו. הפעלת אנרגיה גבוהה עשוי לגרום ניתוק של אחד או יותר יחידות משנה מהמוקד תמים, ולהבהיר את זיקות הגומלין של יחידות משנה שונות. אנו משתמשים בדרך כלל ארגון כגז התנגשות של מלכודת / העברת תאים, למרות היתרונות של השימוש בגז כבדים (למשל, Xe או SF ₆₎ דווחו, אולם גזים אלה הם יקרים יותר באופן משמעותי ¹¹ (איור 3).
3. מומלץ כי אחד או יותר של המדינה תשלום להיבחר לניתוח MS / MS. במקרה של מרכיבים חופפים, רכישת סט של טנדם MS ספקטרה יסייע בפתרון סדרה הממונה על אוכלוסיות שונות. יתר על כן, קובע תשלום גבוה יותר לנתק בקלות רבה יותר, לעומת מדינות תשלום נמוך יותר ^12.
4. בנוסף אפיון של המתחם שלם, הוא הציע subcomplexes קטן פתרון יופק, בתנאים denaturing קלה. MS ו MS / MS ניתוח subcomplexes להוות בסיס הגדרת הארכיטקטורה למקטע של ¹³ מורכבים. עבור שיבוש חלקי של למקטע-למקטע אינטראקציות, בהדרגה להוסיף ממיסים אורגניים (למשל מתנול, isopropanol, או אצטוניטריל) עד ​​ריכוז של 50%, או לשנות את ה-pH של הפתרון על ידי הוספת אמוניה או חומצה פורמית (עד ריכוז של 4 %).
5. כדי לקבוע את המסות של יחידות משנה הפרט שמרכיבים את מורכבות, חשוב לרכוש ספקטרום בתנאים denaturing. זה יכול להתבצע באמצעות מיקוד עצה _C-4 (Millipore) עם יחס מים / אצטוניטריל 25:75, עם חומצה פורמית 1% כפי elution ממס.

חלק 6: עיבוד וניתוח נתונים

1. הוא ניתח נתונים לא מקוון, באמצעות תוכניות ניתוח ספקטרלי עבור MS ספקטרה. בדרך כלל אנחנו משתמשים בתוכנה MassLynx (ווטרס).
2. עבור ספקטרום כי ההיקף מגוון רחב m / z, אנו ממליצים תוכניות שונות של החלקה ופרמטרים centroid להיות מיושם עבור m / z באזורים גבוהים ונמוכים, כדי לשקף את ההבדל ברזולוציה שיא של אזורים אלה.
3. כדי לזהות סדרה תשלום לחשב מדינות תשלום ההמונים, "ידנית למצוא" פונקציה של MassLynx יכול להיות מיושם. במקרים של ספקטרה מסה מורכבת עם רכיבים חופפים, חישוב ידני של ההמונים עשוי להיות קל יותר.
4. כדי להקל את התהליכים האלה המשימה, תוכנה נוספת ניתן להשתמש, למשל: MaxEnt עבור deconvolution ספקטרה ^14, SOMMS עבור הולם שיא סימולציה ^15, וסאמיט לצורך קביעת ההרכב stoichiometry של subcomplexes חלבון ויצירת אינטראקציה חלבון רשתות ^13,16,17 .

חלק 7: תוצאות נציג

באיור 1. הכנת מצופה זהב ננו electrospray נימים.
א לצרף שני דו צדדית רצועות דבק כדי בצלחת פטרי, 2 ס"מ זה מזה. כדי לתמוך נימים מוכן, במקום מוט זכוכית (8 ס"מ x 5 מ"מ) במרכזה של אחת הרפידות. B. סטיק את הצד הקהה ​​של הנימים מוכן משטח דביק, ולהישען על קצה מוט הזכוכית. ג לאחר צלחת פטרי מלאה הנימים מוכן, מעיל אותם עם זהב עד שכבה דקה של זהב מופקד באופן שווה על פני השטח החיצוניים של נימי דם.

איור 2. מסה כיול גבוהים באמצעות יוני יודיד צזיום.
אשכולות גדולים monisotopic של CSI הפכו אותו למתחם של בחירה עבור כיול ספקטרומטרים המונית לניתוח מסה גבוהה. סדרת פסגות ברווחים שווים משתרעים על פני טווח רחב, החל מ '/ z 393 ליותר מ -10,000. הם assigנד טעונה ביחידים אשכולות מלח הרכב הכללי (CSI) _n ⁺ Cs. אותות נוספים בין הפסגות הגדולות נגרמות על ידי זנים כפולה ו משולשת טעונה הסדרה: [(CSI) _n CS2] ^{2 +} ו [(CSI) _n CS3] ^{3 +,} בהתאמה. הגדלת הלחץ בשלב ואקום הראשונית היא חיונית לאיתור מקבצים מסה גבוהה. השפעת הלחץ על הפסגות מסה גבוהה הפגינו פאנלים. ו-B. עם readbacks הלחץ של 1.2 ו - 5.3, בהתאמה. ג. הרחבת ספקטרום המונית מופיע בצד B.

איור 3. Nanoflow electrospray ספקטרה המונית של לקטינים pentameric.
א ספקטרומטריית מסה של מורכבות גרסה לקטינים (הנגזרות B7-Lib1 על ידי אבולוציה מכוונת ¹⁸⁾ מעורר מדינה הפצות תשלום בין 3000 ו - 5000 מ '/ z, אולם בשל desolvation לקוי של היונים, הפסגות רחבות. השוואה של לוח א 'וב' להראות את ההשפעה של הגדלת מתח הטיה של 4V (.) ל 15V (B). על רוחב השיא. עלייה זו גורמת להאצת התנאים הפשטת מים שיורית ורכיבים חיץ, מניב קשת החליטה ביותר. המסה נמדדת (60,240 ± 38 דא) מורכב מתאים pentameric. ג המדינה 15 תשלום נבחרה ואז במקביל MS ניתוח (מוצל באפור בלוח ב '.) ד. הגידול אנרגיה התנגשות גורם לשחרור של מונומר טעונה מאוד, מרוכז ב 1664 מ '/ z, ו מורכב tetrameric הפשיטו, בטווח של 5,000 - 8,000 מ' / z. כל ספקטרום התקבלו ממדגם המכיל 20 מיקרומטר של פתרון אמוניום אצטט 0.5m.

Discussion

כדי להשיג תשומת לב גבוהה ספקטרה איכות צריכה להינתן על הכנת הצעדים מדגם, הכוללים ריכוז מדגם וחילופי חיץ. במהלך דגימות בדילול תניב אות נמוך, ואילו דגימות מרוכז מאוד יכול להיות צמיגה למדי, לחסום את המחט electrospray. יתר על כן, הפתרון תוספים כגון מלחים, גליצרול, חומרי ניקוי, יונים של מתכות, וסוכני צמצום (DTT או β-mercaptoethanol), נוטים לדבוק המשטח החיצוני של החלבונים, ולגרום הרחבת הפסגות. לכן, על מנת להשיג היטב החליטה פסגות, רכיבים אלה יש להוסיף את הריכוזים הנמוכה ביותר האפשרית.

פרמטר נוסף הוא מפתח את המיקום של nanoflow הנים, ביחס פתח ספקטרומטר מסה. למצוא את "הנקודה המתוקה" עשוי להיות מאתגר עבור משתמשים לא מנוסים, ובכל זאת, זה משפיע באופן משמעותי את האיכות של הספקטרום. חשוב גם לבחון nanoflow נימי לפני תחילת תרסיס. גודל טיפה היא פונקציה של קוטר קצה, אשר אמור להיות ~ 1μm. טיפות קטנות להוביל יינון יעיל יותר, ולכן הוא יהיה יתרון. חשוב גם כדי לאמת שאין בועות אוויר בתוך נימי שיכול לחסום את זרימת, וכי ציפוי זהב לא הפשיטו מן נימי במהלך הרכישה, אם כך, עוד לקצץ את קצה. זכור כי כמות מוגזמת של מדגם יגדיל את האפשרות של תנאי אופטימיזציה MS כגון מתח נימי, מתח מאיץ, לחץ, אנרגיה התנגשות.

ככלל, הליכי הסביר בפרוטוקול שימשו כדי לקבוע את ההרכב, stoichiometry ואדריכלות של קומפלקסים חלבונים רבים (ראו ביקורות 2,3,4). ניתוח של קומפלקסים גדולים של מד"א, כמו הריבוזום ¹⁹ ו capsids וירוס הורה מאוד ^20-22, בהגדרת המצע מחייב מכונות מולקולריות ^23-25, או אפיון של רשתות אינטראקציה למקטע ^{26,17,16,17,27,28} לשמש אבל כמה דוגמאות של הערך של גישה זו.

Materials

מדגם	דרישה	תגובות
נפח	1-2 μL	לכל נימי
ריכוז	1-20μM	לפי מורכבות
חוצץ	חיץ Aquanos נדיפים כגון אמוניום אצטט ב-pH = 6-8	בדרך כלל 5 MM-1M
דטרגנט	מינימלי	אשכולות של מולקולות חומר ניקוי לייצר פסגות רחב פתור
גליצרול	מינימלי (עד 5%)	שומרת nonspecifically לחלבונים, וכתוצאה מכך, פסגות רחב נצפות
ממיסים אורגניים	עד 50%	אולי לפגל קומפלקסים חלבונים
חומצות	עד 4%	חלבון מתחמי לפגל
מלחים	מינימלי	Adducts מלח להוביל פסגות רחב פתור
DTT	מינימלי	מיקרומטר 1-2 יכול להיות נוכח
סוכני chelating	מינימלי	מעל 250 מיקרומטר להוביל להיווצרות adduct נרחב