عزل الخلايا الليمفاوية T الإنسان والثقافة والتحليل للهجرة في المختبر</em

Summary

اللمفاويات T الهجرة يحدث أثناء صاروخ موجه إلى الأجهزة اللمفاوية ، والخروج من الأوعية الدموية ، والدخول في الأنسجة الطرفية. هنا ، نحن تصف وضع بروتوكول والتي يمكن استخدامها لتحليل الخلايا اللمفاوية تي الهجرة في المختبر.

Abstract

هجرة الخلايا اللمفية تي ينطوي على تفاعل لاصقة من integrins سطح الخلية مع يغاندس أعرب عن الخلايا الأخرى أو مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية. تفعيل spatiotemporal دقيقة من integrins من حالة تقارب المنخفضة إلى حالة تقارب عالية عند حافة الخلية يؤدي مهمة لمفاوية T الهجرة

Protocol

1. عزل الخلايا اللمفاوية T الإنسان

1. الحصول على دم الإنسان من متبرع سليم. السماح لتبريد الدم إلى درجة حرارة الغرفة (~ 30 دقيقة) قبل الانتقال الى الخطوة التالية.
2. ماصة بلطف 3 مل من درجة حرارة الغرفة وسائل الإعلام تعدد الأشكال التدرج الكثافة في أنبوب 8 مل البوليسترين جولة القاع. إضافة بلطف 3 مل من الدم الكامل على الجزء العلوي من تعدد الأشكال وسائل الاعلام. فمن الأهمية بمكان تجنب الخلط من الكواشف اثنين.
3. أنابيب الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. بعد الطرد المركزي ، وفصل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMC) الآن من مكونات الدم الأخرى في طبقة الخلايا العليا. طبقة PBMC يظهر ، من أعلى إلى أسفل ، والفرقة غائم الأولى.
5. إزالة بعناية واضحة ذات اللون الأصفر المرحلة العليا من الدم ، وفوق الطبقة PBMC ، ومن ثم استخدام micropipette P1000 لنقل طبقة PBMC إلى 15 مل أو 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
6. غسل PBMC مرتين مع برنامج تلفزيوني ، الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق في كل مرة. سوف يكون غائما طاف بعض الشيء بعد كل غسل.

2. ثقافة الخلايا اللمفاوية T الإنسان

1. باستخدام ماصة ، ونقل إلى PBMC T - 75 قارورة الثقافة في 20 مل من وسائل الإعلام التي تحتوي على 1640 RPMI FBS 10 ٪ ، 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين ، و 1 ميكروغرام / مل راصة دموية نباتية (PHA).
2. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ على الأقل 1 ساعة ، وتصل إلى 24 ساعة. هذه الخطوة تسمح حيدات ، والتي سوف تكون ملتصقة على سطح القارورة ، ويمكن فصلها عن الخلايا الليمفاوية التي تبقى في التعليق. إذا تم استخدام حضانة قصيرة (1 ساعة) في هذه الخطوة ، فإنه من غير المقبول استخدام وسائل الإعلام التي تحتوي على RPMI 1640 بنسبة 10 ٪ و 1 ٪ FBS البنسلين / الستربتوميسين دون المكمل مع PHA على النحو المحدد في الخطوة 2.1.
3. إزالة بدقة في جميع وسائل الإعلام من القارورة ، إضافة إلى أنبوب مخروطي 50 مل ، وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
4. Resuspend الخلية بيليه ، الذي يحتوي الآن في المقام الأول الخلايا اللمفية ، ونقل الخلايا إلى قارورة T - 75 الجديدة التي تحتوي على 25 مل تحتوي على وسائل الاعلام RPMI 1640 FBS 10 ٪ ، 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين ، و 1 ميكروغرام / مل PHA.
5. في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام (2 أيام إذا الحضانة الأولية للPBMC كان بين عشية وضحاها). بعد 24 ساعة من النمو ، قد يكون من الضروري إضافة 15-20 مل من وسائل الإعلام الجديدة ونقل إلى أحد أكبر T - 175 قارورة.
6. بعد 3 أيام ، استخدم ماصة لإزالة الخلايا الليمفاوية وسائل الاعلام وعلقت من القارورة ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
7. Resuspend بيليه في الخلية ونقلها إلى الخلايا قارورة T - 75 أو T - 175 الجديدة التي تحتوي على 25 مل (T - 75) أو 50 مل (T - 175) 1640 مع RPMI FBS 10 ٪ ، 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين ، و20 نانوغرام / مل الإنسان IL - 2 أو IL - 15.
8. تنمو الخلايا الليمفاوية ل4-7 أيام. إذا بدءا قارورة T - 75 ، فإن الثقافة يجب أن يتم توسيعها وتحويلها إلى قارورة T - 175 بعد 1-2 أيام.

3. الفحص في المختبر الهجرة اللمفاويات

1. 1 قبل يوم من الفحص والهجرة ، ومعطف الزجاج قاع الطبق 0.17 ملم مع بروتين ميكروغرام / مل 20 ألف أو مجموعة في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
2. غسل الأطباق على نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني.
3. شل ICAM-1/Fc الإنسان (10 ميكروغرام / مل) وقوات الدفاع الذاتى الإنسان - 1. (2 ميكروغرام / مل) وذلك بإضافة هذه الكواشف في محلول PBS إلى الطبق واحتضان 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة
4. تحضير الخلايا اللمفية تي من خلال تحديد الخلية الأولى في كثافة الثقافة في قارورة T - 175 باستخدام عدادة الكريات. وينبغي أن تستخدم ما يقرب من 2-5 × 10 ⁵ خلايا في طبق لتحقيق كثافة الخلية المناسبة لتحليل الهجرة.
5. غسل الخلايا اللمفية تي مرتين مع برنامج تلفزيوني وresuspend ثم في وسائل الإعلام 1 L - 15 مل تحتوي على 1 ملغ / مل مد الجلوكوز.
6. غسل الصحون المغلفة مع ICAM-1/Fc وقوات الدفاع الذاتى 1 - نطاق واسع مع برنامج تلفزيوني.
7. نقل الخلايا اللمفية تي في وسائل الإعلام مل 1 إلى الطبق والمحافظة عليها عند 37 درجة مئوية.

4. التقاط تسلسل الصور باستخدام برمجيات عناصر شيكل

1. فتح شيكل عناصر البرنامج.
2. في قائمة إعدادات الكاميرا ، اختر "binning 2X2" كوضع لكلا التصوير والتقاط الصور الحية.
3. انتقل إلى القائمة واختيار تطبيقات تحديد / تشغيل التجربة.
4. اختيار طول الفترة الزمنية بين الصور وبطول إجمالي للصورة التقاط تسلسل.
5. اضغط على "تشغيل" الزر لبدء الحصول على الصور.
6. ويمكن تعقب الخلايا والمعلمات الهجرة (السرعة ، وطول المسار ، والتشرد ، وما إلى ذلك) كميا باستخدام واحدة من عدة مجموعات البرمجيات ، بما في ذلك ImageJ ، أو AutoQuant Volocity (الشكل 1).
7. لإنشاء "شبكة عنكبوتية المؤامرة ، و" س ص إحداثيات يتم جمع كل خلية وtimepoint (الشكل 2) والمسقطة على الرسم البياني مع نقطة انطلاق مشتركة لكل خلية في الأصل (الشكل 3).

5. ممثل النتائج

يوم للثقافة لمدة 6 أيام في وجود إما الخلايا اللمفية تي IL - 2 أو IL - 15 ،يشكلون> 98 ٪ من الخلايا ، على النحو الذي يحدده تلطيخ CD3 الإيجابية وكذلك CD4 إيجابية وتلطيخ / أو CD8. لIL - 2 ، وجدنا CD4 + الخلايا 83 ٪ ، 15 ٪ CD8 + و

الشكل 1. سمح لتتبع خلية من الخلايا اللمفية تي المهاجرة. الخلايا اللمفية تي المعزولة من الدم الكامل والمثقف في وجود أو IL - 2 IL - 15 لمدة 6 أيام إلى التمسك بها وترحيل على الزجاج ذات قاع الأطباق المغلفة مع 10 ميكروغرام / مل ICAM - 1 و 2 ميكروغرام / مل SDF - 1. تم الحصول على الصور كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة. وقد تم تحديد الخلايا في كل صورة وتتبعها على مر الزمن باستخدام البرمجيات Volocity. هذا الفيلم يتناول الهجرة العشوائية من الخلايا اللمفية تي في سرعة ميكرومتر 15 ~ / دقيقة.

انقر هنا لمشاهدة الفيديو.
تتبع الفيلم خلية 1. ترحيل الخلايا اللمفية تي. الخلايا اللمفية تي المعزولة من الدم الكامل والمثقف في حضور IL - 2 أو سمح IL - 15 لمدة 6 أيام إلى التمسك بها وترحيل على أطباق ذات قاع الزجاج المطلي مع 10 ميكروغرام / مل ICAM - 1 و 2 ميكروغرام / مل SDF - 1 . تم الحصول على الصور كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة. وقد تم تحديد الخلايا في كل صورة وتتبعها على مر الزمن باستخدام البرمجيات Volocity. هذا الفيلم يتناول الهجرة العشوائية من الخلايا اللمفية تي في سرعة ميكرومتر 15 ~ / دقيقة.

الشكل 2. Spatiotemporal موقف الخلية. تم الحصول على إحداثيات XY كل خلية لكل نقطة باستخدام برنامج Volocity الوقت.

الشكل 3. "نسيج العنكبوت مؤامرة". باستخدام XYt إحداثيات لكل خلية ، تم اختيار 15 الخلايا على نحو عشوائي ، وتآمر مع نقطة انطلاق مشتركة في الأصل. مقارنة المؤامرات العنكبوت يعطي تصوير بصرية سريعة للخلافات بين الهجرة في ظروف تجريبية مختلفة. مؤامرات للهجرة تي اللمفاوية تحت ظروف التحكم (اللوحة اليسرى) ، وفي وجود الأجسام المضادة يجند حجب مكافحة LFA - 1 (اللوحة اليمنى).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

في هذه التجربة ، ونحن نقدم تفاصيل عن نظام بسيط لتحليل حركية الأولية اللمفاويات التائية البشرية. المقايسات في المختبر الهجرة استخدمت لتشريح أدوار العديد من الجزيئات ومسارات إشارات تشارك في تحرك من مختلف أنواع الخلايا. بعض عناصر التحكم الحرجة أن نأخذ في الاعتبار...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. human IL-2	R&D Systems	202-IL
Rec. human IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
Rec. human SDF-1	R&D Systems	350-NS