Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

Resumen

La migración de los linfocitos T se produce durante la recalada de los órganos linfoides, la salida de la vasculatura, y entrar en los tejidos periféricos. Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para analizar la migración de los linfocitos T In vitro.

Resumen

La migración de los linfocitos T implica la interacción adhesiva de las integrinas de la superficie celular con ligandos expresados ​​en otras células o con proteínas de la matriz extracelular. La activación precisa espacio-temporal de las integrinas de un estado de baja afinidad a un estado de alta afinidad en el borde de la célula principal es importante para la migración de los linfocitos T

Protocolo

1. Aislamiento de linfocitos T humanos

1. Obtener sangre humana de un donante sano. Permitir que la sangre se enfríe a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de proceder al siguiente paso.
2. Suavemente la pipeta de 3 ml de la temperatura ambiente media del gradiente de densidad Polimorfia en un tubo de poliestireno de 8 ml de fondo redondo. Suavemente agregar 3 ml de sangre total en la parte superior de los medios de comunicación Polimorfia. Es importante evitar la mezcla de los dos reactivos.
3. Centrifugar los tubos a 500 xg durante 45 minutos a temperatura ambiente.
4. Después de la centrifugación, las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) se han separado de otros componentes sanguíneos en la capa de células superior. La capa de PBMC parece, de arriba hacia abajo, como la banda de nubes en primer lugar.
5. Retire con cuidado las claras de color amarillo fase superior de la sangre, por encima de la capa de PBMC, y luego usar una micropipeta P1000 para la transferencia de la capa de PBMC a una de 15 ml o 50 ml de tubo cónico.
6. Lave la PBMC dos veces con PBS, centrifugar las células a 500 xg durante 5 minutos cada vez. El sobrenadante será algo nublado después de cada lavado.

2. Cultura de los linfocitos T humanos

1. Con una pipeta, transferir los PBMC de un frasco T-75 en 20 ml de la cultura medio RPMI 1640 con 10% de SFB, 1% penicilina / estreptomicina, y 1 mg / ml fitohemaglutinina (PHA).
2. Se incuba a 37 ° C y 5% de CO ₂ por lo menos durante una hora, y hasta 24 horas. Este paso permite a los monocitos, que se adhiere a la superficie de frasco, a separarse de los linfocitos que permanecen en suspensión. Si una incubación corta (1 hora) se utiliza en este paso, es aceptable el uso de medio RPMI 1640 con 10% de SFB y 1% de penicilina / estreptomicina sin complementar con la APS como se especifica en el paso 2.1.
3. Retire con cuidado todos los medios de comunicación desde el matraz, añadir a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 500 xg durante 5 minutos.
4. Resuspender el botón celular, que ahora contiene principalmente los linfocitos, las células y la transferencia a un nuevo T-75 frasco contiene 25 ml de RPMI 1640 con 10% de SFB, 1% penicilina / estreptomicina, y 1 mg / ml de PHA.
5. Se incuba a 37 ° C durante 3 días (2 días si la primera incubación de PBMC fue durante la noche). Después de 24 horas de crecimiento, puede ser necesario añadir 15-20 ml de medio fresco y la transferencia a un T-175 más grandes matraz.
6. Después de 3 días, utilizar una pipeta para retirar los medios de comunicación y los linfocitos suspendido del matraz y un tubo cónico de 50 ml. Centrifugar a 500 xg durante 5 minutos.
7. Resuspender el botón celular y las células de la transferencia a un nuevo frasco T-75 o T-175 que contiene 25 ml (T-75) o 50 ml (T-175) RPMI 1640 con 10% de SFB, 1% penicilina / estreptomicina, y 20 ng / mL de IL-2 o IL-15.
8. Linfocitos crecen de 4-7 días. Si se comienza con un frasco T-75, la cultura tendrá que ser ampliado y trasladado a un matraz T-175 después de 1-2 días.

3. En el ensayo in vitro de la migración de linfocitos

1. 1 día antes de la prueba de la migración, un abrigo con fondo de vidrio 0,17 mm plato con 20 mg / ml de proteína A o G en PBS durante una noche a 4 ° C.
2. Lavar el plato extensamente con PBS.
3. Inmovilizar humanos ICAM-1/Fc (10 mg / mL) y humanos SDF-1 (2 mg / mL) mediante la adición de estos reactivos en una solución de PBS para el plato y la incubación de 4 horas a temperatura ambiente.
4. Prepare los linfocitos T, en primer lugar la determinación de la densidad de las células en cultivo en el matraz T-175 con un hemocitómetro. Aproximadamente 2.5 x 10 ⁵ células se debe utilizar por plato para conseguir una densidad celular apropiada para el análisis de la migración.
5. Lave los linfocitos T dos veces con PBS y luego volver a suspender en 1 ml de L-15 los medios de comunicación que contiene 1 mg / ml de D-glucosa.
6. Lavar el plato cubierto con ICAM-1/Fc y SDF-1 extensamente con PBS.
7. La transferencia de linfocitos T en un ml de medio para el plato y mantenerlos a 37 ° C.

4. Captura de una secuencia de imágenes Uso de NIS Software Elementos

1. Abrir NIS software Elements.
2. En el menú de ajustes de la cámara, seleccione "binning 2x2" como el modo de dos imágenes en vivo y captura de imágenes.
3. Vaya al menú Aplicaciones y seleccione Definir / experimento se ejecute.
4. Elija la cantidad de tiempo entre las imágenes y la longitud total de la secuencia de captura de imágenes.
5. Pulse el botón "Ejecutar" para iniciar la adquisición de imágenes.
6. Las células se pueden seguir y los parámetros de la migración (velocidad, longitud de la trayectoria, desplazamiento, etc) cuantificó usando uno de varios paquetes de software, incluyendo ImageJ, AutoQuant o Volocity (Figura 1).
7. Para generar un "complot tela de araña", las coordenadas xy para cada celda y punto de tiempo se recogen (Figura 2) y se proyecta sobre un gráfico con un punto de partida común para cada celda en el origen (Figura 3).

5. Resultados representante

El día 6 de cultivo en presencia de IL-2 o IL-15, los linfocitos Tconstituyen> 98% de las células, según lo determinado por tinción CD3 positivos, así como CD4 positivos y tinción / o CD8. De IL-2, se encontró 83% de CD4 + en las células, el 15% CD8 + y <1% de CD4 + CD8 +. De IL-15, encontramos 88% de CD4 + en las células, el 11% CD8 + y <1% de CD4 + CD8 +. Durante la migración de los linfocitos T en ICAM-1/SDF-1 sustratos, las células mostraron una velocidad de aproximadamente 15 micras / min que puede ser mantenido durante un período de 1 hora. La migración de los linfocitos T en ICAM-1/SDF-1 depende de LFA-1 mediada por la adhesión, como un anti-LFA-1 ligando anticuerpo bloqueante inhibe seriamente la migración.

Figura 1. Seguimiento de la migración de células linfocitos T. Linfocitos T aislados de sangre total y se cultivan en presencia de IL-2 o IL-15 durante 6 días se permite que se adhieran y migrar a fondo de cristal platos recubiertos con 10 mg / mL de ICAM-1 y 2 mg / mL SDF-1. Las imágenes fueron adquiridas cada 10 segundos durante 30 minutos. Las células fueron identificadas en cada imagen y el seguimiento en el tiempo utilizando el software Volocity. Esta película muestra la migración al azar de los linfocitos T a una velocidad de unos 15 m / min.

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Movie 1. Celular de seguimiento de la migración de los linfocitos T. Los linfocitos T aislados de sangre total y se cultivan en presencia de IL-2 o IL-15 durante 6 días se permite que se adhieran y migrar en los platos con fondo de vidrio recubierta con 10 mg / mL de ICAM-1 y 2 mg / ml SDF-1 . Las imágenes fueron adquiridas cada 10 segundos durante 30 minutos. Las células fueron identificadas en cada imagen y el seguimiento en el tiempo utilizando el software Volocity. Esta película muestra la migración al azar de los linfocitos T a una velocidad de unos 15 m / min.

Figura 2. Posición de la célula espacio-temporal. Las coordenadas XY de cada célula se obtuvieron para cada momento el uso de software Volocity.

Figura 3. "Spider parcela web." Utilizando el XYT coordenadas para cada celda, 15 células fueron escogidos al azar y se representa con un punto de partida común en el origen. Comparando las parcelas tela de araña da una representación visual rápida de las diferencias en la migración entre diferentes condiciones experimentales. Parcelas para la migración de los linfocitos T en condiciones control (izquierda) y en presencia de un anti-LFA-1 ligando anticuerpo bloqueante (panel derecho).

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Discusión

En este experimento, se proporcionan detalles sobre un sistema sencillo para analizar la movilidad de primaria linfocitos T humanos. En los ensayos de migración in vitro se han utilizado para analizar el papel de muchas moléculas y vías de señalización implicadas en la locomoción de los diversos tipos de células. Algunos controles críticos a tener en cuenta a la hora de diseñar su propio experimento de nuestro protocolo son: 1) revestimientos adhesivos no adhesivo o no la integrina-su...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. human IL-2	R&D Systems	202-IL
Rec. human IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
Rec. human SDF-1	R&D Systems	350-NS