Человеческий Т-лимфоцитов изоляции, культуры и анализ миграции In Vitro</em

Резюме

Т-лимфоцитов происходит во время миграции самонаведения для лимфоидных органов, выход из сосудистой сети, и вступление в периферических тканях. Здесь мы опишем протокол, который может быть использован для анализа миграции Т-лимфоцитов В пробирке.

Аннотация

Миграции Т-лимфоцитов включает в себя клей взаимодействия интегрины клеточной поверхности с лигандами, выраженные на другие клетки или с белками внеклеточного матрикса. Точное пространственно-временной активации интегринов из низком состоянии сродство к высоким сродством состояние на клеточном передний край имеет важное значение для Т-лимфоцитов миграции

протокол

1. Выделение лимфоцитов человека Т

1. Получить крови человека от здорового донора. Дайте крови остыть до комнатной температуры (~ 30 мин), прежде чем перейти к следующему шагу.
2. Аккуратно пипетки 3 мл комнатной температуре СМИ Polymorph градиента плотности в 8 мл с круглым дном полистирола трубки. Аккуратно добавить 3 мл цельной крови на вершине Превращение средств массовой информации. Важно, чтобы избежать смешивания двух реагентов.
3. Центрифуга труб при 500 мкг в течение 45 минут при комнатной температуре.
4. После центрифугирования, мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) в настоящее время отделены от других компонентов крови в верхний слой клеток. Слой РВМС оказывается, сверху вниз, как первый облачный группы.
5. Осторожно снимите прозрачного желтого цвета верхней фазе крови, прежде РВМС слой, а затем использовать P1000 микропипетки для передачи РВМС слоя на 15 мл или 50 мл коническую трубку.
6. Вымойте РВМС дважды с PBS, центрифугирования клетки при 500 мкг в течение 5 минут каждый раз. Супернатант будет несколько облачно после каждого мытья.

2. Культуры лимфоцитов человека Т

1. Используя пипетку, передача РВМС к Т-75 культура колбе в 20 мл RPMI 1640 среде, содержащей 10% FBS, 1% пенициллин / стрептомицин, и 1 мкг / мл фитогемагглютинином (PHA).
2. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO ₂ в течение 1 часа, и до 24 часов. Этот шаг позволяет моноциты, которые будут приверженцем колбы поверхность, должны быть отделены от лимфоцитов, которые остаются во взвешенном состоянии. Если короткий инкубационный (1 час) используется на этот шаг, то это приемлемо использовать RPMI 1640 среде, содержащей 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина без выделения дополнительного ФГА, как указано в пункте 2.1.
3. Осторожно удалите все носители из колбу, добавьте его в 50 мл коническую трубку, и центрифуги при 500 мкг в течение 5 минут.
4. Ресуспендируют клеточный осадок, который на данный момент содержит лимфоцитов, и передачи клеткам новых Т-75 колбу, содержащую 25 мл RPMI 1640 среде, содержащей 10% FBS, 1% пенициллин / стрептомицин, и 1 мкг / мл ФГА.
5. Инкубировать при 37 ° С в течение 3 дней (2 дня, если начальная инкубации РВМС была ночь). Через 24 часов роста, это может быть необходимо добавить 15-20 мл свежей информации и передачи больших Т-175 колбу.
6. Через 3 дня, используйте пипетку для удаления информации и приостановлено лимфоцитов из колбы и трансфер в 50 мл коническую трубку. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 минут.
7. Ресуспендируют осадок клеток и передачи клеткам новую колбу Т-75 или Т-175, содержащий 25 мл (Т-75) или 50 мл (Т-175) RPMI 1640 с 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина и 20 нг / мл человеческого IL-2 или ИЛ-15.
8. Расти лимфоцитов в течение 4-7 дней. Если, начиная с Т-75 колбу, культуры должны быть расширены и переведены в T-175 колбу через 1-2 дней.

3. In Vitro Пробирной миграции лимфоцитов

1. 1 день до миграции анализа, пальто со стеклянным дном 0,17 мм блюдо с 20 мкг / мл белка или G в PBS в течение ночи при 4 ° C.
2. Вымойте блюдо экстенсивно с PBS.
3. Обездвижить человека ICAM-1/Fc (10 мкг / мл) и человека SDF-1 (2 мкг / мл), добавляя этих реагентов в растворе PBS, чтобы блюдо и инкубации 4 часов при комнатной температуре.
4. Подготовка Т-лимфоцитов, сначала определения плотности клеток в культуре Т-175 колбу использованием hemacytometer. Примерно 2-5 х 10 ^{5 клеток} должны быть использованы на чашку для достижения плотности клеток подходит для миграции анализа.
5. Вымойте Т-лимфоцитов в два раза с PBS, а затем ресуспендируют в 1 мл L-15 среде, содержащей 1 мг / мл D-глюкозы.
6. Вымойте блюдо покрытые ICAM-1/Fc и SDF-1 экстенсивно с PBS.
7. Передача Т-лимфоцитов в 1 мл до СМИ блюдо и поддерживать их при температуре 37 ° C.

4. Захват последовательности изображений Использование NIS Элементы программного обеспечения

1. Открытое NIS Элементы программного обеспечения.
2. В меню настройки камеры, выберите "2x2 биннинга" в качестве режима для обеих жить изображений и изображений.
3. Переход к меню Приложения и выберите команду Определить / Выполнить эксперимент.
4. Выберите период времени между изображениями и общая длина последовательности захвата изображения.
5. Нажмите кнопку "Выполнить" для начала получения изображений.
6. Клетки могут быть отслежены и миграции параметры (скорость, длина пути, перемещение и т.д.) количественно, используя один из нескольких программных пакетов, в том числе ImageJ, AutoQuant или Volocity (рис. 1).
7. Для создания "паутину заговора," ху координат для каждой ячейки и timepoint собираются (рис. 2) и проецируется на граф с общей отправной точкой для каждой ячейки в начале координат (рис. 3).

5. Представитель Результаты

На 6-й день культуры в присутствии либо ИЛ-2 или ИЛ-15, Т-лимфоцитысоставляет> 98% клеток, как это определено положительное окрашивание CD3, а также положительные CD4 и / или CD8 окрашивания. Для Ил-2, мы обнаружили 83% клеток CD4 +, 15% CD8 + и <1% CD4 + CD8 + клеток. Для Ил-15, мы обнаружили 88% клеток CD4 +, 11% CD8 + и <1% CD4 + CD8 + клеток. Во время Т-лимфоцитов миграции на ICAM-1/SDF-1 субстраты, клетки выставлены скоростью около 15 мкм / мин, что может быть устойчивой в течение 1 периода времени час. Т-лимфоцитов миграции на ICAM-1/SDF-1 зависит от LFA-1-опосредованной адгезии, как анти-LFA-1 лиганд-блокирующий антитела сильно тормозит миграцию.

Рисунок 1. Сотовые отслеживания миграции Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты изолированы от цельной крови и культивировали в присутствии ИЛ-2 или ИЛ-15 в течение 6 дней было разрешено придерживаться и мигрируют по стеклянным дном блюда покрыта 10 мкг / мл ICAM-1 и 2 мкг / мл SDF-1. Изображения были получены через каждые 10 секунд в течение 30 минут. Клетки были выявлены в каждом изображении и проследить во времени, используя Volocity программного обеспечения. Этот фильм показывает случайную миграцию Т-лимфоцитов со скоростью ~ 15 мкм / мин.

Нажмите здесь для просмотра видео.
Фильм 1. Сотовый отслеживания миграции Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты изолированы от цельной крови и культивировали в присутствии ИЛ-2 или ИЛ-15 в течение 6 дней было разрешено придерживаться и мигрируют по стеклянным дном блюда покрыта 10 мкг / мл ICAM-1 и 2 мкг / мл SDF-1 . Изображения были получены через каждые 10 секунд в течение 30 минут. Клетки были выявлены в каждом изображении и проследить во времени, используя Volocity программного обеспечения. Этот фильм показывает случайную миграцию Т-лимфоцитов со скоростью ~ 15 мкм / мин.

Рисунок 2. Пространственно-временные позиции ячейки. Координат XY каждой клетки были получены для каждой точки с помощью Volocity программного обеспечения.

Рисунок 3. "Паутину заговора". Использование XYt координаты для каждой ячейки, 15 ячеек были выбраны случайным образом и заговор с общей отправной точкой в ​​начале координат. Сравнение участков паутина дает быстрый визуальной информации о различиях в миграции между различными условиями эксперимента. Участки для миграции Т-лимфоцитов под контролем условиях (слева) и в присутствии анти-LFA-1 лиганд-блокирующий антитела (правая панель).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этом эксперименте мы предоставляем подробную информацию о простой системы для анализа подвижности первичных человеческих Т-лимфоцитов. В анализах пробирке миграции были использованы для рассекать ролей многих молекул и сигнальных путей, участвующих в локомоции различны?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. human IL-2	R&D Systems	202-IL
Rec. human IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
Rec. human SDF-1	R&D Systems	350-NS