Isolamento T de linfócitos humanos, Cultura e Análise da Migração In Vitro</em

Resumo

Migração de linfócitos T ocorre durante homing para órgãos linfóides, saia do vasculatura, e entrando em tecidos periféricos. Aqui, nós descrevemos um protocolo que pode ser usado para analisar migração de linfócitos T In vitro.

Resumo

A migração de linfócitos T envolve a interação adesivo de integrinas da superfície celular com ligantes expressos em outras células ou com proteínas da matriz extracelular. A ativação das integrinas preciso espaço-temporal de um estado de baixa afinidade para um estado de alta afinidade no limite da célula líder é importante para a migração de linfócitos T

Protocolo

1. Isolamento de linfócitos T humanos

1. Obter sangue humano a partir de um doador saudável. Permitir que o sangue esfriar até a temperatura ambiente (~ 30 min) antes de prosseguir para a próxima etapa.
2. Suavemente pipeta de 3 mL de temperatura ambiente Polymorph media gradiente de densidade em um tubo de poliestireno 8 mL de fundo redondo. Delicadamente adicionar 3 mL de sangue total em cima da mídia Polymorph. É importante evitar a mistura dos dois reagentes.
3. Centrifugar os tubos a 500 xg por 45 minutos em temperatura ambiente.
4. Após a centrifugação, as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) já separado de outros componentes do sangue para a camada de células superior. A camada de PBMC aparece, de cima para baixo, como a primeira banda nublado.
5. Remova cuidadosamente a fase de cor amarela clara superior do sangue, acima da camada de PBMC, e então usar uma micropipeta P1000 para transferir a camada CMSP para um mL 15 mL ou 50 tubo cônico.
6. Lave o PBMC duas vezes com PBS, centrifugação a 500 xg células por 5 minutos cada tempo. O sobrenadante será um pouco nublado depois de cada lavagem.

2. Cultura de linfócitos humanos T

1. Com uma pipeta, transferir o CMSP para um balão T-75 da cultura em 20 mL de mídia RPMI 1640 contendo 10% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, e 1 mg / mL fitohemaglutinina (PHA).
2. Incubar a 37 ° C e 5% CO ₂ por pelo menos uma hora, e até 24 horas. Esta etapa permite que os monócitos, que será aderente à superfície balão, ser separada da linfócitos que permanecem em suspensão. Se um de incubação curto (1 hora) é usado nesta etapa, é aceitável a utilização de meios RPMI 1640 contendo 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina, sem suplementação com PHA, conforme especificado no passo 2.1.
3. Remova cuidadosamente toda a mídia do frasco, adicione-o a um tubo cônico de 50 mL, e centrifugar a 500 xg por 5 minutos.
4. Ressuspender o pellet celular, que agora contém principalmente linfócitos, as células e transferência para um balão T-75 novo contendo 25 mL de mídia RPMI 1640 contendo 10% FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, e 1 mg / mL PHA.
5. Incubar a 37 ° C por 3 dias (2 dias se a incubação inicial de PBMC foi durante a noite). Após 24 horas de crescimento, pode ser necessário adicionar mL 15-20 de mídia fresco e transferir para um maior T-175 frasco.
6. Após 3 dias, use uma pipeta para remover a mídia e os linfócitos suspenso a partir do frasco e transferir para um tubo cônico de 50 mL. Centrifugar a 500 xg por 5 minutos.
7. Ressuspender o pellet celular e células transferir para um balão T-75 ou T-175 nova contendo 25 mL (T-75) ou 50 mL (T-175) RPMI 1640 com 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, e 20 ng / mL humana IL-2 ou IL-15.
8. Crescer linfócitos para 4-7 dias. Se começar com um frasco de T-75, a cultura terá de ser ampliado e transferido para um balão T-175, após 1-2 dias.

3. Ensaio in vitro de migração de linfócitos

1. Um dia antes do ensaio de migração, um casaco com fundo de vidro prato de 0,17 milímetros, com 20 Protein mcg / ml A ou G, em PBS overnight a 4 ° C.
2. Lavar o prato extensivamente com PBS.
3. Imobilizar ICAM-1/Fc humano (10 mg / mL) e humanos SDF-1 (2 mg / mL), adicionando estes reagentes em solução PBS para o prato e incubação de quatro horas à temperatura ambiente.
4. Prepare linfócitos T pela primeira determinação da densidade de células em cultura no frasco T-175 utilizando um hemocitômetro. Cerca de 2-5 x 10 ⁵ células deve ser usado por prato para conseguir uma densidade celular adequada para a análise de migração.
5. Lavar linfócitos T duas vezes com PBS e, em seguida ressuspender em 1 mL L-15 meios contendo 1 mg / mL D-glicose.
6. Lavar o prato revestido com ICAM-1/Fc e SDF-1 extensivamente com PBS.
7. Transferência de linfócitos T em 1 mL de mídia para o prato e mantê-las a 37 ° C.

4. Capturar uma seqüência de imagem usando NIS Elements Software

1. Abra NIS Elements software.
2. No menu de configurações da câmera, escolha "binning 2x2" como o modo para ambas imagens ao vivo e captura de imagem.
3. Vá ao menu Aplicações e escolha Definir / Run Experiment.
4. Escolher o comprimento de tempo entre as imagens eo comprimento total da seqüência de captura de imagem.
5. Pressione o botão "Executar" para começar a aquisição da imagem.
6. As células podem ser rastreados e os parâmetros de migração (velocidade, comprimento do caminho, deslocamento, etc) quantificados usando um dos vários pacotes de software, incluindo ImageJ, Autoquant ou Volocity (Figura 1).
7. Para gerar um "complô teia de aranha", o coordenadas xy para cada célula e timepoint são coletados (Figura 2) e projetada em um gráfico com um ponto de partida comum para cada célula na origem (Figura 3).

5. Resultados representante

No dia 6 de cultura na presença de ambos os linfócitos IL-2 ou IL-15, Tcompõem> 98% de células, conforme determinado pela coloração CD3 positivos, bem como CD4 positivos e / ou CD8 coloração. Para IL-2, encontramos 83% CD4 + células, 15% CD8 + e <1% CD4 + CD8 +. Para IL-15, encontramos 88% CD4 + células, 11% CD8 + e <1% CD4 + CD8 +. Durante a migração de linfócitos T em ICAM-1/SDF-1 substratos, as células apresentaram uma velocidade de aproximadamente 15 mm / min, que pode ser sustentado ao longo de um período de tempo de 1 hora. Migração de linfócitos T em ICAM-1/SDF-1 é dependente de LFA-1 mediada por adesão, como um anti-LFA-1-ligante bloqueio anticorpo inibe fortemente a migração.

Figura 1. Rastreamento de celular de migração de linfócitos T. Linfócitos T isolados do sangue total e cultivadas na presença de IL-2 ou IL-15 para seis dias foram autorizados a aderir e migrar em pratos de vidro de fundo revestido com 10 mg / mL ICAM-1 e 2 mg / mL SDF-1. Imagens foram obtidas a cada 10 segundos por 30 minutos. As células foram identificadas em cada imagem e monitorados ao longo do tempo usando o software Volocity. Este filme mostra a migração aleatória de linfócitos T a uma velocidade de ~ 15 mm / min.

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Filme de rastreamento Cell 1. Migrando de linfócitos T. Linfócitos T isolados do sangue total e cultivadas na presença de IL-2 ou IL-15 para seis dias foram autorizados a aderir e migrar em pratos de vidro de fundo revestido com 10 mg / mL ICAM-1 e 2 mcg / mL SDF-1 . Imagens foram obtidas a cada 10 segundos por 30 minutos. As células foram identificadas em cada imagem e monitorados ao longo do tempo usando o software Volocity. Este filme mostra a migração aleatória de linfócitos T a uma velocidade de ~ 15 mm / min.

Figura 2. Spatiotemporal posição da célula. As coordenadas XY de cada célula foram obtidos para cada ponto de tempo usando software Volocity.

Figura 3. "Spider enredo web." Usando o XYT coordenadas para cada célula, 15 células foram escolhidos aleatoriamente e plotados com um ponto de partida comum na origem. Comparando parcelas teia de aranha dá uma representação visual rápida das diferenças na migração entre diferentes condições experimentais. Parcelas para migração de linfócitos T em condições controle (painel esquerdo) e na presença de um anti-LFA-1 anticorpo ligando-blocking (painel direito).

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Discussão

Neste experimento, nós fornecemos detalhes sobre um sistema simples para analisar a motilidade do principal linfócitos T humanos. Ensaios de migração in vitro têm sido usadas para dissecar os papéis de muitas moléculas e vias de sinalização envolvidas na locomoção de vários tipos de células. Alguns controles fundamentais para manter em mente ao projetar sua própria experiência de nosso protocolo incluem: 1) não-adesiva ou não-integrina revestimentos adesivos, substratos tais como album...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640	GIBCO, by Life Technologies	11875
FBS	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH300070.03
Penicillin-Streptomycin	GIBCO, by Life Technologies	15140
1-Step Polymorphs	Accurate Chemical & Scientific Corporation	AN221725
PHA	Remel, Thermo Fisher Scientific	R30852801
Rec. human IL-2	R&D Systems	202-IL
Rec. human IL-15	R&D Systems	247-IL
Protein G	Sigma-Aldrich	19459
Rec. human ICAM-1/Fc	R&D Systems	720-IC
Rec. human SDF-1	R&D Systems	350-NS