الكيميائي استجابة الكائنات المجهرية البحرية الصغيرة الحجم لطبقات غذائية

Summary

موصوفة تلفيق قنوات ميكروفلويديك وتنفيذها في تجارب لدراسة السلوك الكيميائي تستخدم علفا للميكروبات البحرية داخل المغذيات الطبيعية البرية والبحرية وسلوك غير مكتمل للسباحة داخل البكتيريا تدفق القص.

Abstract

والدرجة التي يمكن أن تستغل الميكروبات العوالق بقع الموارد الميكروسكيل لها آثار كبيرة للالديناميكية المحيطية والتمويه البيوجيوكيميائية. ومع ذلك ، للاستفادة من بقع المغذيات في المحيطات ، والميكروبات السباحة يجب التغلب على تأثيرات القوى المادية بما في ذلك نشر الجزيئية والقص المضطربة ، والتي سوف تحد من توافر بقع وقدرة البكتيريا على العثور عليهم. حتى وقت قريب ، قد حالت دون قيود المنهجية الفحوص الجرثومية المباشرة للسلوك داخل الموائل غير متجانسة وواقعية ظروف التدفق على نطاق صغير. وبالتالي ، فقد تم شراء الكثير من معرفتنا الحالية بشأن السلوك الميكروبي في المحيط من التنبؤات النظرية. للحصول على معلومات جديدة عن السلوك تستخدم علفا للميكروبات في المحيطات لدينا تطبيق تقنيات التصنيع لينة الطباعة الحجرية لتطوير أجهزة ميكروفلويديك 2 ، والتي استخدمناها لإنشاء (ط) الميكروسكيل بقع المغذيات ذات أبعاد وخصائص ناشر ذات الصلة لعمليات المحيطات والميكروسكيل (II) الدوامات ، مع معدلات مماثلة لتلك القص المتوقع في المحيط. وقد أتاحت هذه الأجهزة ميكروفلويديك الفحص الاول المباشر للسباحة الميكروبية والسلوك الكيميائي داخل المناظر البحرية غير المتجانسة والحيوية. الجمع بين استخدام والتخلص epifluorescence المجهري المقابل تسمح الامتحانات مباشرة للأبعاد المادية والخصائص ناشر من بقع المواد الغذائية ، مع مراعاة استجابة حصري على مستوى السكان ، بالإضافة إلى السلوك الفردي للسباحة الميكروبات. وقد كشفت هذه التجارب أن بعض أنواع العوالق النباتية والبكتيريا متغايرة والأولانيات ابتلاعي التغذي بارعون في تحديد مكان واستغلال الموارد الميكروسكيل بقع نشرها ضمن أطر زمنية قصيرة جدا. أظهرنا أيضا أن تصل إلى معدلات معتدلة القص ، والبكتيريا البحرية قادرة على مكافحة تدفق والسباحة من خلال بيئتهم في تلقاء نفسها. ومع ذلك ، ما وراء القص مستوى عتبة عالية ، تتماشى البكتيريا في تدفق القص وأقل قدرة على السباحة من دون إزعاج من التدفق. على microfluidics يمثل نهجا جديدا وغير مكلفة لدراسة البيئة المائية الميكروبية ، ونظرا لمدى ملاءمتها لخلق مجالات تدفق بدقة واقعية والتدرجات الركيزة في microscale ، ينطبق بشكل مثالي لامتحانات السلوك الميكروبية في موازين أصغر من التفاعل. ولذلك نقترح على microfluidics يمثل أداة قيمة للحصول على فهم أفضل لإيكولوجيا كائنات دقيقة في المحيط.

Protocol

إعداد

1. إنشاء قناع

باستخدام برامج CAD ، تصميم قناة للطباعة عالية الدقة على الشفافية. وسوف يكون هذا "قناع".

في غرفة نظيفة :

2. خبز نظيفة والرقاقة

أولا ، بخ الرقاقة مع الأسيتون ، ثم سرعان ما مع الميثانول ، ثم مع الأيزوبروبانول. أخيرا ، الجافة الرقاقة باستخدام النيتروجين.

خبز الرقاقة في الفرن (130 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.

3. طلاء الرقاقة

وضع رقاقة في مركز للآلة تدور طلاء. من أجل مقاومة للضوء (SU - 8) من الزجاجة على الرقاقة. السماح لتدفق SU - 8 والاسترخاء لS. 10 ~ بدوره على المغطي الجانبية وتصل سرعته المنحدر 0-500 دورة في الدقيقة ما يزيد على 5 في الثانية ؛ الاحتفاظ ب 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية ؛ منحدر يصل إلى السرعة النهائية على 10 ثانية وتحافظ على السرعة النهائية لمدة 30 ثانية. سرعة النهائي يعتمد على سماكة طبقة المستهدفة وSU - 8 المستخدمة. ويمكن الاطلاع على التفاصيل في http://www.microchem.com/

4. لينة خبز

بعد طلاء الرقاقة ، خبز لأول مرة في 65 درجة مئوية ، ثم في 95 درجة مئوية. الوقت يختلف مع الخبز سمك المستهدفة ونوع من مقاومة للضوء المستخدمة. ثم ، والسماح للرقاقة الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق على الأقل.

5. تعرض

وضع قناع على رأس رقاقة وفضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية في الوقت الموصى به في دليل SU - 8.

6. بعد التعرض للخبز

خبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية ثم بعد SU - 8 في دليل التعليمات.

7. تطوير رقاقة للحصول على "سيد" (القالب)

إعداد كوب مملوء المطور (PMMA). تزج الرقاقة في الدورق بلطف جدا بينما تتأرجح الدورق حتى يتم غسلها جزء غير معلن من مقاوم الضوء بعيدا.

في مختبرنا :

8. إعداد PDMS وسكبه على الرقاقة

مزيج PDMS مع وكيلها في علاج نسبة 10:01 في فنجان. ويحرك مزيج متجانس فإنه : هذه سوف تولد الكثير من الفقاعات وجعل خليط تبدو مبهمة. يصب الخليط على "سيد".

9. دي فقاعة في فراغ الغرفة

لإزالة فقاعات ، ويوضع الخليط الماجستير والتي تغطي PDMS قبل ان تتحول الى فراغ الغرفة حتى تختفي جميع الفقاعات.

10. الخبز في الفرن

أخبز لمدة لا تقل عن 12 ساعة في الفرن عند 65 درجة مئوية إلى تصلب PDMS.

11. لكمة ثقوب

انزع PDMS من الماجستير والثقوب لكمة لمداخل ومنافذ للقنوات.

في غرف الأبحاث (لا يظهر)

12. البلازما الرابطة

مستعبدين القنوات لشريحة زجاجية بعد معالجة كل طبقة PDMS وشريحة زجاجية مع البلازما الأكسجين لمدة 1 دقيقة.

التجارب :

إكسب # 1 : التحقيق في استجابة الكيميائي من الجراثيم البحرية على النطاق الصغير طبقات المغذيات

1) إعداد التجربة

1. إضافة إلى الكائنات الحية وركائز الزجاج المحاقن
2. مكان قناة ميكروفلويديك على مرحلة المجهر ونعلق أنابيب لمداخل ومنافذ مناسبة
3. توصيل الأنابيب إلى خزان النفايات. تأكد من أنابيب مغمورة تماما في السائل في خزان النفايات لتجنب التذبذبات الضغط
4. مكان الحقن على ضخ حقنة والاتصال صمامات وأنابيب
5. إعداد المجهر : ظروف الإضاءة ، التكبير ، الخ.
6. التركيز على الموقف المناسب في القناة
7. دي فقاعة قناة باستخدام أكبر حقنة مليئة بمياه البحر الاصطناعي
8. مجموعة مناسبة معدل التدفق على ضخ حقنة. في هذه الحالة 2 مل / دقيقة ، والتي تتطابق مع سرعة تدفق يعني ^-1 220 ميكرومتر ليالي في القناة

2) تشغيل التجربة

1. بدء ضخ حقنة لإنشاء معامل المواد الغذائية في القناة
2. مرة واحدة واستقر تدفق مجموعة من المواد المغذية قد وضعت ، ووقف تدفق على ضخ حقنة وبدء تسجيل الوقت من هذه النقطة
3. الفرقة المغذيات يبدأ منتشر أفقيا
4. على فترات زمنية منتظمة ، واستخدام برمجيات تحليل الصور لتسجيل تسلسل الإطارات لإنشاء "الأفلام"
5. تميز الكائنات السباحة من خلال اتخاذ الوقت الفرق بين الصور إطارين لاحقة ، بحيث الكائنات فقط تتحرك الآن تصور ، مما يسمح لنا للتمييز الخلايا متحركة من غير تحريك الجسيمات والضوضاء في الخلفية
6. أفلام اتخاذ مواقف لتحديد الخلايا في القناة مع الإشارة إلى عosition من التصحيح المغذيات
7. تسجيل الأفلام على فترات منتظمة لمدة 10-20 دقيقة لتحليل المواقف وأنماط السباحة من الكائنات الحية
8. باستخدام برنامج تحليل الصور إلى فرض المواقف من الكائنات الحية في أطر مختلفة (تكليف كل بكسل شدة الضوء القصوى المسجلة في ذلك بكسل على مدى مدة الفيلم) ، يمكننا الحصول على معلومات عن مسار الخلايا السباحة

إكسب # 2 : التحقيق في الآثار المترتبة على القص على البكتيريا البحرية السباحة في vortexZ

1. باستخدام هندسة قناة مختلفة ، يمكن أن نلاحظ سلوك البكتيريا تسبح في دوامة بمعدلات مختلفة القص

Discussion

فهم كيف تتفاعل مع الجراثيم البحرية الكيماوية المحلية والبيئة المادية أمر حتمي لتصور أكثر اكتمالا والدقيق للدور الكائنات الدقيقة في العوالق المغذيات المحيطات ودورات الكربون (عزام وMalfatti 2007). ومع ذلك ، ونظرا لجداول صغيرة (<ملم) على كثير من التفاعلات التي تجري الميكروبية الهامة ،...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS, Sylgard 184	Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		http://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100	Photoresist	MicroChem Corp.		www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope	Microscope	Nikon Instruments
PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD)	Tool	Upchurch Scientific		www.upchurch.com
Syringes (Luer-Lok Tip)	Tool	BD Biosciences
Fitting Part P-704-01	Tool	Upchurch Scientific		To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes
Syringe Pump (PHD 2000 Programmable)	Equipment	Harvard Apparatus
CCD Camera (PCO 1600)	Equipment	Cook