תגובת Chemotactic של מיקרו אורגניזמים ימיים כדי Micro-Scale שכבות מזין

Summary

ייצור של ערוצי microfluidic ויישומן ניסויים לחקר התנהגות ליקוט chemotactic של חיידקים ימיים בתוך נוף ים מזין אחידה והתנהגות שחייה של חיידקים בתוך זרם גזירה מתוארים.

Abstract

המידה שבה planktonic חיידקים יכולים לנצל משאב טלאים microscale יהיו השלכות ניכרות trophodynamics האוקיאנית ושטף biogeochemical. עם זאת, כדי לנצל את תיקוני מזין בים, חיידקים שחייה להתגבר על ההשפעות של כוחות פיזיים כולל דיפוזיה מולקולרית גזירה סוערים, אשר יגבילו את הזמינות של טלאים ואת היכולת של חיידקים כדי לאתר אותם. עד לאחרונה, יש מגבלות מתודולוגיות בדיקות מנועה ישירה של התנהגות של חיידקים בתוך בתי גידול בלתי סדיר ומציאותי בקנה מידה קטן בתנאי זרימה. לפיכך, רוב הידע הנוכחי שלנו לגבי התנהגות של חיידקים בים כבר רכש מהתחזיות התיאורטיות לגביו. כדי להשיג מידע חדש על התנהגות שיחור מזון מיקרוביאלי באוקיינוס ​​יישמנו רך טכניקות ייצור ליתוגרפיות לפתח 2 מכשירים microfluidic, אשר השתמשנו כדי ליצור (i) microscale טלאים מזין עם ממדים ומאפיינים diffusive רלוונטי תהליכים האוקיאנית (ii) microscale מערבולות, עם שיעורי גזירה המקביל לאלה צפוי בים. אלה מכשירים microfluidic התירו בדיקה הישירה הראשונה של השחייה חיידקים וההתנהגות chemotactic בתוך נוף ים הטרוגני ודינמי. השימוש בשילוב של epifluorescence והניגודיות מיקרוסקופיה שלב לאפשר בדיקות ישירה של ממדים פיזיים המאפיינים diffusive טלאים מזין, תוך שמירה על התגובה האוכלוסייה ברמה המצרפית, בנוסף להתנהגות שחייה של חיידקים בודדים. ניסויים אלה גילו כי כמה מינים של פיטופלנקטון, חיידקים heterotrophic ו הפרוטיסטים phagotrophic המיומנים באיתור וניצול לשדר טלאים משאב microscale בתוך מסגרות זמן קצר מאוד. הראינו גם כי עד מתונה בשיעורי גזירה, חיידקים ימיים המסוגלים להילחם זרימה לשחות דרך הסביבה שלהם מרצונם. עם זאת, מעבר לרמת סף גזירה גבוהה, חיידקים מיושרים בזרימת גזירה ומסוגלים פחות שחייה ללא הפרעה מן הזרם. מיקרופלואידיקה מייצג גישה חדשנית וזולה לחקר האקולוגיה של חיידקים ימיים, והן בשל התאמתה במדויק יצירת שדות זרימה מציאותי והדרגות המצע על microscale, הוא החלים באופן אידיאלי בדיקות של התנהגות חיידקים על המאזניים הקטן של אינטראקציה. לפיכך, אנו מציעים כי מיקרופלואידיקה מהווה כלי חשוב להשגת הבנה טובה יותר של האקולוגיה של מיקרואורגניזמים בים.

Protocol

הכנה

1. יצירת מסכה

שימוש בתוכנת תיב"ם, עיצוב הערוץ עבור הדפסה ברזולוציה גבוהה על שקיפות. זה יהיה "מסכה".

בחדר נקי:

2. נקה ואופים רקיק

ראשית, רקיק להשפריץ עם אצטון, אז מהר עם מתנול, ולאחר מכן עם Isopropanol. לבסוף, לייבש את פרוסות סיליקון באמצעות חנקן.

אופים את פרוסות בתנור (130 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות.

3. ציפוי רקיק

מניחים את פרוסות במרכז מכונה ספין הציפוי. יוצקים photoresist (SU-8) מהבקבוק על פרוסות סיליקון. תן את זרימת SU-8 ולהירגע עבור ~ 10 s. הפעל coater הכביסה, כבש את מהירותה עד 0-500 סל"ד מעל 5 s; לשמור על סל"ד 500 עבור s 10, כבש עד מהירות סופית של מעל 10 ולשמור על מהירות סופית 30 s. המהירות הסופית תלויה עובי הציפוי ממוקד SU-8 בשימוש. פרטים ניתן למצוא בכתובת http://www.microchem.com/

4. רכים לאפות

לאחר ציפוי רקיק, לאפות אותו לראשונה בגיל 65 ° C ולאחר מכן ב 95 ° C. זמן האפייה משתנה עם עובי סוג ממוקד של photoresist בשימוש. אז, בואו פרוסות סיליקון בטמפרטורת החדר במשך לפחות 5 דקות.

5. חשיפה

מניחים את המסכה על גבי פרוסות סיליקון ולחשוף את רקיק לאור UV בפעם מומלץ במדריך SU-8.

6. לאחר חשיפה לאפות

אופים את פרוסות סיליקון ב 65 ° C ולאחר מכן 95 ° C בעקבות SU-8 הוראות שימוש.

7. פיתוח רקיק כדי להשיג את "מאסטר" (עובש)

הכינו כוס מלא היזם (PMMA). לטבול את פרוסות לתוך כוס תוך נדנוד בעדינות את הכוס עד שלא נחשפו חלק של photoresist הוא נשטף.

במעבדה שלנו:

8. הכן PDMS ושופכים אותו על פרוסות סיליקון

מערבבים את PDMS עם סוכן ריפוי שלה ביחס 10:01 לתוך כוס. בוחשים ומערבבים homogenously: זה יפיק המון בועות להפוך את התערובת מבט אטום. יוצקים את התערובת על "אמן".

9. דה בועה בחלל ריק קאמרית

כדי להסיר את הבועות, הניח את התערובת אב PDMS כי הוא מכסה אותה לתוך תא ריק עד שכל הבועות נעלמו.

10. אפייה בתנור

אופים במשך לפחות 12 שעות בתנור ב 65 ° C להקשיח את PDMS.

11. פאנץ חורים

קולפים את PDMS מן האדון וחורים אגרוף עבור פתחי הכניסה שקעים של הערוצים.

בכל חדר נקי (לא מוצג)

12. פלזמה מליטה

ערוצי מודבקים לשקופית זכוכית לאחר הטיפול הן את שכבת PDMS ואת שקופיות זכוכית עם פלזמה חמצן דקות 1.

ניסויים:

Exp # 1: לחקור את התגובה chemotactic של חיידקים ימיים כדי מיקרו סולם שכבות תזונה

1) הגדרת הניסוי

1. הוסף אורגניזמים מצעים כדי מזרקים זכוכית
2. המקום ערוץ microfluidic לבמה מיקרוסקופ ולצרף צינורות אל פתחי הכניסה שקעים המתאים
3. חיבור צינורות לבזבז המאגר. ודא צינורות הוא שקוע כולו מאגר פסולת בנוזל, כדי למנוע תנודות בלחץ
4. מזרקים מקום על משאבת מזרק להתחבר שסתומים צינורות
5. הגדרת מיקרוסקופ: בתנאי אור, הגדלה וכו '
6. פוקוס על המיקום המתאים בערוץ
7. דה בועה הערוץ באמצעות מזרק גדול מלא במי ים מלאכותי
8. הגדר קצב הזרימה המתאים על משאבת מזרק. במקרה זה 2 מ"ל / דקה, אשר תואמים את מהירות זרימה ממוצעת של 220 s ^-1 מיקרומטר בערוץ

2) הפעלת הניסוי

1. הפעל את משאבת מזרק להקים שיפוע מזין בערוץ
2. לאחר זרימה התייצב ותזמורת של חומרים מזינים פיתחה, לעצור את הזרימה על המשאבה את המזרק ולהתחיל זמן הקלטה מנקודה זו
3. הלהקה מזין מתחיל מפוזר רוחבית
4. במרווחי זמן קבועים, שימוש בתוכנות ניתוח תמונה להקליט רצף של מסגרות כדי ליצור "סרטים"
5. להפלות אורגניזמים שחייה ידי נטילת זמן ההבדל בין שתי מסגרות לתמונות הבאות, כך שרק אובייקטים נעים כעת דמיינו, מה שמאפשר לנו להבדיל בין תאים ניעתי שאינו זז חלקיקים רעשי רקע
6. קח סרטים לקבוע עמדות של תאים בערוץ תוך התייחסות position התיקון מזין
7. סרטים שיא במרווחי זמן קבועים במשך 10-20 דקות לנתח את עמדות ודפוסי השחייה של אורגניזמים
8. באמצעות תוכנת ניתוח התמונה כדי להניח את העמדות של אורגניזמים במסגרות שונות (הקצאת כל פיקסל בעוצמת האור המרבית נרשמה פיקסל שבמהלך תקופת הסרט), אנו יכולים לקבל מידע על מסלול תאים שחייה

Exp # 2: לחקור את ההשפעות של גזירה על חיידקים ימיים שחייה vortexZ

1. שימוש בגיאומטריה ערוצים שונים, אנחנו יכולים לצפות את ההתנהגות של חיידקים שחייה במערבולת בשיעורים גזירה שונים

Discussion

הבנה של האופן שבו חיידקים ימיים אינטראקציה עם כימיקל המקומית שלהם הסביבה הפיזית הכרחי עבור תפיסה מלאה ומדויקת יותר של התפקיד של מיקרואורגניזמים planktonic ב מזין האוקיינוסים ופחמן מחזורים (עזאם ו Malfatti 2007). עם זאת, בשל המאזניים קטן (מ"מ <) על אינטראקציות אשר רבים של חיידקים חשובים ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS, Sylgard 184	Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		http://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100	Photoresist	MicroChem Corp.		www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope	Microscope	Nikon Instruments
PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD)	Tool	Upchurch Scientific		www.upchurch.com
Syringes (Luer-Lok Tip)	Tool	BD Biosciences
Fitting Part P-704-01	Tool	Upchurch Scientific		To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes
Syringe Pump (PHD 2000 Programmable)	Equipment	Harvard Apparatus
CCD Camera (PCO 1600)	Equipment	Cook