Хемотаксиса Реакция морской микроорганизмов к Micro-Scale питательных слоев

Резюме

Изготовление микрожидкостных каналов и их реализация в экспериментах для изучения хемотаксиса нагула поведение морских микробов в питательную пятнистый морской пейзаж и плавание поведение бактерий в сдвиговом потоке описаны.

Аннотация

Степень, в которой планктонных микробов могут использовать микромасштабной патчи ресурс будет иметь значительные последствия для океанических трофодинамика и биогеохимических потоков. Однако, чтобы воспользоваться питательной пятна в океане, плавание микробы должны преодолеть влияние физических сил в том числе молекулярной диффузии и турбулентного сдвига, который будет ограничивать доступность патчей и способность бактерий, чтобы найти их. До недавнего времени методологические ограничения есть исключается прямое экзаменов микробного поведения в местах обитания пятнистый и реалистичные мелкие условиях потока. Таким образом, большая часть наших знаний о микробной поведения в океан, было получено от теоретических предсказаний. Для получения новой информации о микробной нагула поведения в океане мы применили мягкие литографических методов изготовления развивать 2 микрожидкостных устройств, которые мы использовали для создания (я) микромасштабной питательных пятна с размерами и характеристиками диффузионного отношение к океанических процессов и (II) микромасштабной вихрей, с скоростях сдвига, соответствующие этим ожидается в океан. Эти микрожидкостных устройств позволили первое прямое изучение микробной плавания и хемотаксиса поведения в гетерогенных и динамические морской пейзаж. Комбинированное использование epifluorescence и микроскопии фазового контраста позволяют осуществлять прямое обследование физические размеры и диффузионных характеристик питательных патчей, в то время как наблюдения на уровне населения агрегатного ответа, в дополнение к плаванию поведении отдельных микробов. Эти эксперименты показали, что некоторые виды фитопланктона, гетеротрофных бактерий и простейших phagotrophic имеют большой опыт по поиску и использованию диффундирующих микромасштабной патчи ресурсов в очень короткие сроки. Мы также показали, что до умеренных скоростях сдвига, морские бактерии способны бороться с потоком и плавать в их среде по собственному желанию. Тем не менее, за порог высокий уровень сдвига, бактерии ориентированы в сдвиговом потоке и менее способны плавание без нарушения из потока. Microfluidics представляет собой новый и недорогой подход к изучению водной экологии микробов, и из-за его пригодность для точного создания реалистичных поля потока и подложки градиенты на микроуровне, идеально применимы к экзаменам микробного поведения на самых малых масштабов взаимодействия. Поэтому мы предлагаем микрофлюидики представляет собой ценный инструмент для получения лучшего понимания экологии микроорганизмов в океане.

протокол

Подготовка

1. Создайте маску

Использование программного обеспечения CAD, дизайн канала для печати с высоким разрешением на прозрачность. Это будет "Маска".

В чистой комнате:

2. Чистота и выпекать пластины

Во-первых, струя пластины с ацетоном, а затем быстро с метанолом, затем с изопропанола. Наконец, сухие пластины использованием азота.

Выпекать пластины в духовку (130 ° C) в течение 5 мин.

3. Покрытие пластин

Место пластины в центре спин-покрытие машины. Налейте фоторезиста (ГУ-8) из бутылки на пластине. Пусть SU-8 потоков и отдохнуть в течение ~ 10 с Включите спин-рампа для нанесения покрытий и его ускорения с 0 до 500 оборотов в минуту в течение 5 с, держать на 500 оборотов в минуту в течение 10 с; рампы до конечной скоростью более 10 с и поддерживает на конечной скоростью в течение 30 сек Конечная скорость зависит от целевой толщины покрытия и SU-8 используется. Подробную информацию можно найти на http://www.microchem.com/

4. Soft-печь

После нанесения покрытия на пластины, испечь его первым при 65 ° С, а затем при 95 ° C. Время выпечки зависит от целевой толщины и типа фоторезиста используется. Тогда, позвольте пластины сидеть при комнатной температуре в течение не менее 5 мин.

5. Экспозиция

Место маски в верхней части пластины и разоблачить пластины УФ-свет на время, рекомендуется в СУ-8 руководства.

6. Постконтактная испечь

Выпекать пластин при 65 ° С, а затем 95 ° C следующих SU-8 Инструкция по.

7. Разработка пластин для получения "мастер" (форм)

Подготовка стакан заполнен разработчиком (PMMA). Погрузите пластин в мензурку в то время как очень мягко осциллирующих стакан, пока часть неэкспонированные из фоторезиста вымываются.

В нашей лаборатории:

8. Подготовка PDMS и залить его на пластины

Смешайте PDMS с отвердителем в соотношении 10:1 в чашку. Перемешать и смешать его однородно: это будет генерировать много пузырьков и сделать смесь выглядят непрозрачными. Вылейте смесь на "мастер".

9. Де-пузырь в вакуумной камере

Для удаления пузырьков, расположенных мастера и PDMS смесь, которая покрывает его в вакуумную камеру, пока все пузырьки исчезли.

10. Выпечки в духовке

Выпекать в течение по крайней мере 12 часов в духовке при температуре 65 ° С, чтобы укрепиться PDMS.

11. Пробивки отверстий

Снимите PDMS от мастера и пробивки отверстий для входов и выходов из каналов.

В чистом помещении (не показаны)

12. Плазменные связи

Каналы крепятся к стеклу после лечения как слой PDMS и стекло с кислородной плазмы в течение 1 мин.

Эксперименты:

Опыт № 1: Исследование хемотаксиса ответ морских микробов к микро-масштабе питательного слоя

1) Настройка эксперимента

1. Добавить организмы и субстраты для стекла шприцы
2. Место микрожидкостных канал на столик микроскопа и приложить трубку к соответствующим входы и выходы
3. Подключите трубку тратить водохранилище. Убедитесь, что трубка полностью погружен в жидкость в резервуар отходов, чтобы избежать колебаний давления
4. Место шприцы на шприцевой насос и подключиться к клапаны и трубы
5. Настройка микроскопа: освещенности, увеличение и т.д.
6. Сосредоточьтесь на соответствующую позицию в канале
7. Де-пузырь канал с помощью больших шприц с искусственной морской воде
8. Установите соответствующие скорости потока на шприцевой насос. В этом случае 2 мл / мин, что соответствует средней скорости потока ^-1 220 мкм с в канале

2) Запуск эксперимента

1. Начало шприцевой насос установить питательный градиент в канале
2. Как только поток стабилизировался и группа питательных веществ, разработал, остановить поток на шприцевой насос и начинают записи с этой точки
3. Питательные группа начинает диффузного боков
4. Через равные промежутки времени, использование программного обеспечения для анализа изображений для записи последовательности кадров для создания "Фильмы"
5. Дискриминация плавание организмов путем принятия временной разницы между двумя изображениями последующих кадрах, так что только движущиеся объекты теперь визуализировать, что позволяет нам различать подвижных клеток из неподвижных частиц и фоновых шумов
6. Возьмите фильмы, чтобы определить позиции клеток в канал со ссылкой на рosition из питательных патч
7. Запись фильмов на регулярной основе в течение 10-20 мин для анализа позиций и плавание моделей организмов
8. Используя программное обеспечение для анализа изображений для наложения позиции организмов в разных кадрах (назначение на каждый пиксель максимальной интенсивности света, записанные в этом пикселе в течение срока действия фильма), можно получить траекторию информации для купания клетки

Опыт № 2: Исследование эффектов сдвига на морских бактерий купание в vortexZ

1. Используя различные геометрии канала, мы можем наблюдать поведение бактерий купание в вихре на различных скоростях сдвига

Обсуждение

Понимание того, как морские микроорганизмы взаимодействуют с местными химической и физической среды необходимо для более полного и точного восприятия роли планктонных микроорганизмов в океане питательных веществ и углеродного цикла (Azam и Малфатти 2007). Однако из-за малых масштабах (<мм), по кото?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS, Sylgard 184	Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		http://www.ellsworth.com/sylgard.html
SU8-2100	Photoresist	MicroChem Corp.		www.microchem.com
Nikon Eclipse TE2000-E inverted microscope	Microscope	Nikon Instruments
PEEK tubing (0.762 mm ID, 1.59 mm OD)	Tool	Upchurch Scientific		www.upchurch.com
Syringes (Luer-Lok Tip)	Tool	BD Biosciences
Fitting Part P-704-01	Tool	Upchurch Scientific		To connect tubing to Luer-Lok Tip Syringes
Syringe Pump (PHD 2000 Programmable)	Equipment	Harvard Apparatus
CCD Camera (PCO 1600)	Equipment	Cook