في البروتوكول الموقع للأجنحة الفراشة العذراء طريق Riboprobes

Summary

من أجل دراسة التعبير الجيني في أنسجة الجناح العذراء من anynana Bicyclus ، نقدم بروتوكول الأمثل لفي الموقع التهجين باستخدام riboprobes. كما نقوم بتوفير مبادئ توجيهية لمزيد من التحسين على هذا البروتوكول لاستخدامها في أجنحة العذراء الأنواع Lepidopteran الأخرى.

Abstract

هنا نقدم ، في شكل شرائط فيديو ، وبروتوكول لالتهجين في الموقع في أجنحة العذراء من anynana Bicyclus فراشة riboprobes به. التهجين في الموقع ، وهي الدعامة الأساسية لعلم الأحياء التطوري ومفيدة لدراسة الأنماط المكانية والزمانية في التعبير الجيني في أنسجة النامية على مستوى النسخ. إذا الأجسام المضادة التي تستهدف منتجات البروتين من النسخ الجيني لم يتم تطويرها ، و / أو وجود نسخ متعددة من الجينات بروتين معين في الخريطة الوراثية البشرية التي لا يمكن أن تكون متباينة باستخدام الاجسام المضادة المتوفرة ، يمكن أن تستخدم في مكان المال بدلا من ذلك. في حين أن الوضع الطبيعي للتقنية أقراص الجناح اليرقات كانت متاحة للمجتمع فراشة لعدة سنوات ، وقد تم تحسين البروتوكول الحالي لأجنحة العذراء أكبر وأكثر هشاشة.

Protocol

DAY 1

1. إعداد الحلول التالية :
   • 10X PBS
   • 1X PBS
   • 1X PBT
   • DDH ₂ O
     • إضافة DEPC عن الحجم الكلي 0.1 ٪ ويهز الحلول بقوة.
     • الأوتوكلاف.
   • 4 ٪ لامتصاص العرق فيكس -- باستخدام برنامج تلفزيوني ، DEPC
   • بروتين K الحل -- إذا كان موجودا متعجل ، دوامة بقوة قبل إزالة قسامة
   • الهضم إيقاف مؤقت
   • Prehybridization العازلة
   • 50:50 PBT : الاحتياطي Prehybridization
   • التهجين العازلة
     • يجب أن تبقى الحلول ريبونوكلياز خالية. إما استخدام الزجاج وير التي تم خبز (4 ساعات بمعدل 250 درجة مئوية) أو البلاستيكية. ماصات المصلية مفيدة جدا لصنع ما يصل حلول
2. تشريح أجنحة من الوقت قام الشرانق في برنامج تلفزيوني
3. الانتقال مباشرة إلى الأجنحة إصلاح الاحتياطي في الآبار من 24 لوحة الثقافة جيدا في درجة حرارة الغرفة
4. الإصلاح أقراص لمدة 2 ساعة
5. يغسل 5 × 5 دقائق في PBT
6. احتضان أجنحة لمدة 3 دقائق في محلول K بروتيناز
7. شطف 2 x في مخزن إيقاف الهضم
8. يغسل 5 × 5 دقائق في PBT
9. غسل 2 × 5 دقائق في PBT 50:50 : PHB
10. يغسل 1 × 10 دقيقة في PHB
11. احتضان في ساعة ما لا يقل عن 1 PHB في 55 درجة مئوية.
12. الحرارة تفسد RNA التحقيق (20 50ng اللازمة لكل بئر) (80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق) وإضافة إلى تهجين العازلة (100 ميكرولتر اللازمة لكل بئر)
13. إضافة إلى التحقيق الآبار واحتضان 48 ساعة عند 55 درجة مئوية

اليوم 3

1. يغسل 4 × 5 دقائق في درجة حرارة 55 مئوية PHB
2. بين عشية وضحاها في احتضان PHB عند 55 درجة مئوية

اليوم 4

1. إعداد الحلول التالية :
   • الأضداد كتلة عازلة
2. يغسل 1 × 5 دقائق في PBT 50:50 : PHB
3. يغسل 4 × 5 دقائق في PBT
4. أجنحة احتضان لمدة 1 ساعة في مخزن في بلوك 4 درجات مئوية
5. احتضان أجنحة في التخفيف 1:2000 المضادة للحفر الأضداد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية

يوم 5

1. إعداد الحلول التالية :
   • الكشف عن مخزن
   • الحل النامية -- (التفاف في احباط) الضوء الحساسة
2. تغسل 3 × 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في PBT
3. يغسل 7 × 5 دقائق في PBT
4. شطف جناحي مرات في الكشف عن مخزن
5. تطوير أجنحة في 1 مل من محلول النامية -- يجب مراقبة الوقت للتنمية في كل مرة -- مرة النامية يمكن أن تتغير حتى عند استخدام نفس تحقيقات والحل النامية -- الاختيار عادة بعد 5-10 دقائق ثم زيادة فترات تصل إلى بين عشية وضحاها. وينبغي أن تكون ملفوفة في احباط لوحة لمنع التعرض للضوء عند عدم التحقق من العينات.
6. شطف خمس مرات في إيقاف مؤقت النامية
7. جبل الأجنحة.

Discussion

تعظيم الاستفادة من البروتوكولات القائمة

التهجين في الموقع على أقراص الجناح اليرقات أجريت بنجاح باستخدام أقراص من الفراشات coenia نبذة (كارول وآخرون 1994 ؛. كيز وآخرون 1999 ؛. Weatherbee وآخرون 1999). وقد تم تكييف البروتوكول الحالي من بروتوكول الخطية المفصلة متوفرة ع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fix Buffer				4% Paraformaldehyde in PBS
PBT				0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution				2.5mg/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer				2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer				For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer				Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer				50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA
Anti-DIG	Ab	Roche Group	11 093 274 910	Alkaline Phosphatase conjugated
DIG Wash and Block Buffer Set		Roche Group	11 585 762 001
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium		Sigma-Aldrich	C0612	Mounting Medium