リボプローブを用いたバタフライ蛹ウィングスのためのその場プロトコルで

要約

Bicyclus anynanaの蛹の翼の組織における遺伝子発現を調べるために、我々はリボプローブを用いてサイチュハイブリダイゼーションのために最適化されたプロトコルを提示する。我々はまた、他のチョウ目の種の蛹の翼で使用するためにこのプロトコルのさらなる最適化のためのガイドラインを提供しています。

要約

ここでは、ビデオフォーマットで、リボプローブを使用して蝶Bicyclus anynanaの蛹の翼のサイチュハイブリダイゼーションのためのプロトコルを提示する。サイチュハイブリダイゼーションでは、発生生物学の主流は、転写レベルでの組織を開発する際に遺伝子発現の空間的および時間的パターンを研究するのに便利です。遺伝子の転写のタンパク質産物はまだ開発、および/または内臓で、入手可能な抗体を用いて区別することができないゲノムの特定のタンパク質の複数の遺伝子のコピーが存在していないターゲット抗体が代わりに使用することができる場合。幼虫の翼のディスクの現場テクニックで数年間、蝶のコミュニティに利用されていますが、現在のプロトコルは、より大規模で脆弱な蛹の翼のために最適化されています。

プロトコル

1日目

1. 以下のソリューションを準備します。
   • 10倍PBS
   • 1X PBS
   • 1X PBT
   • のddH ₂ O
     • 0.1パーセント合計ボリュームに対して、DEPCを追加し、積極的にソリューションを振る。
     • オートクレーブ。
   • 4％パラホルムアルデヒド修正 - PBS - DEPCを使用して
   • プロテイナーゼK溶液 - アリコートを取り外す前に、精力的に沈殿物が存在する場合には、渦
   • 消化ストップバッファー
   • プレハイブリダイゼーションバッファー
   • 50:50 PBT：プレハイブリダイゼーションバッファー
   • ハイブリダイゼーションバッファー
     • ソリューションは、RNaseフリーに保つ必要があります。どちら焼きされたガラスウエア（250で4時間° C）または使い捨てのプラスチックを使用してください。血清学的ピペットは、ソリューションを構成するために非常に便利です
2. PBS中で蛹を上演時から翼を解剖する
3. 室温で24穴培養プレートのウェルにバッファを修正するために直接翼を移動する
4. 2時間のディスクを修正
5. PBTで5 × ​​5分間洗浄
6. プロティナーゼK溶液で3分間の翼をインキュベート
7. 消化ストップバッファーで2 ×をすすぐ
8. PBTで5 × ​​5分間洗浄
9. PHB：50:50 PBTの2 × 5分間洗浄
10. PHBの1 × 10分間洗浄
11. 55 PHB少なくとも1時間のインキュベート℃の
12. 熱変性RNAプローブ（20 - 50ngよくごとに必要な）（80℃で5分間）とハイブリダイゼーション緩衝液（100μlのウェル毎に必要）に追加
13. ウェルにプローブを追加し、55℃で48時間インキュベート° C

3日目

1. 55で4 × 5分間洗浄° C PHB
2. 55 PHBで一晩インキュベート° C

4日目

1. 以下のソリューションを準備します。
   • 抗体のブロックバッファ
2. PHB：50:50 PBTで1 × 5分間洗浄
3. PBTで4 × 5分間洗浄
4. 4のブロックバッファ内で1時間インキュベート翼は° C
5. 一晩4抗DIG抗体の1:2000希釈で翼をインキュベート° C

5日目

1. 以下のソリューションを準備します。
   • 検出バッファー
   • 現像液 - 敏感な光（ホイルでラップ）
2. 室温でPBTの3 × 5分間洗浄
3. PBTで洗浄7 × 5分
4. 検出用バッファー中で翼を2回リンス
5. ソリューションの開発の1 mlの翼を開発 - 開発の時間は、それぞれの時間を監視する必要がある - 時間を開発する同じプローブを使用してソリューションを開発する際にも変更できる - 一般的には一晩に間隔を増やしてから5-10分後にチェックして。プレートは、サンプルをチェックしない場合は光の暴露を防止するためにホイルで包まれるべきである。
6. 開発停止バッファーで5回リンス
7. 翼をマウントします。

ディスカッション

既存のプロトコルの最適化

（。。らキーズ1999;。ウェザーら1999。キャロルら1994）幼虫の翼ディスクが正常にPRECIS coeniaの蝶からディスクを使用して実行されているのin situハイブリダイゼーション。現在のプロトコルは、幼虫の翼stainingsのためのキャロルの研究室からのリクエストも承ります詳細な書面によるプロトコルから適応されています。我々が行った変更は、幼虫と蛹の翅の組織の違いに対応?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fix Buffer				4% Paraformaldehyde in PBS
PBT				0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution				2.5mg/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer				2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer				For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer				Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer				50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA
Anti-DIG	Ab	Roche Group	11 093 274 910	Alkaline Phosphatase conjugated
DIG Wash and Block Buffer Set		Roche Group	11 585 762 001
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium		Sigma-Aldrich	C0612	Mounting Medium