Riboprobes kullanarak Kelebek pupa Wings in situ Protokolü

Özet

Bicyclus anynana pupa kanat dokusu gen ekspresyonu incelemek için, riboprobes kullanarak yerinde döllemeler için optimize edilmiş bir protokol mevcut. Biz de bu protokolün diğer lepidopteran türlerin pupa kanatları kullanmak için daha fazla optimizasyon için yönergeler sağlar.

Özet

Burada, video formatı, riboprobes kullanarak kelebek Bicyclus anynana pupa kanatları in situ döllemeler için bir protokol mevcut. Yerinde döllemeler, gelişim biyolojisi bir dayanak noktası, transkripsiyon düzeyinde, gelişmekte olan dokularda gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desen çalışması için faydalıdır. Gen transkripsiyonu ve protein ürünleri hedef alan antikorlar henüz geliştirilen ve / veya mevcut antikorlar kullanılarak ayırt edilemez genomunda belli bir protein birden fazla gen kopyaları bulunmaktadır edilmemiştir varsa, situs yerine kullanılabilir. Larva kanat diskler için yerinde teknik bir kaç yıl için kelebek topluluk olmasına karşın, mevcut protokol daha büyük ve daha kırılgan bir pupa kanatlar için optimize edilmiştir.

Protokol

1. GÜN

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   • 10x PBS
   • 1x PBS
   • 1x PBT
   • GKD ₂ O
     • % 0.1 'lik toplam hacmi DEPC ekleyin ve şiddetle çözümler sallamak.
     • Otoklav.
   • % 4 Paraformaldehit Fix - PBS-DEPC
   • Proteinaz K çözüm çökelti varsa, vorteks şiddetle kısım çıkarmadan önce
   • Sindirim Durdur Tamponu
   • Prehybridization Tampon
   • 50:50 PBT: Prehybridization Tampon
   • Hibridizasyon Tampon
     • Çözümler RNaz ücretsiz tutulmalıdır. Ya da pişmiş cam eşya (4 saat 250 ° C) ya da atılabilir plastik kullanın. Serolojik pipetler çözümleri yapmak için çok kullanışlıdır
2. PBS içinde kanatları teşrih zaman aşamalı pupa
3. Oda sıcaklığında 24 kuyu kültür plaka kuyularda Tampon saptamak için doğrudan kanatları hareket ettirme
4. 2 saat için diskler Fix
5. PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın
6. Proteinaz K çözüm, 3 dakika boyunca kanatları inkübe
7. Sindirim Durdur Tamponu 2 x durulayın
8. PBT olarak 5 x 5 dakika yıkayın
9. 50:50 PBT 2 x 5 dakika Yıkama: PHB
10. PHB olarak 1 x 10 dakika yıkayın
11. PHB en az 1 saat inkübe 55 ° C.
12. Isı doğasını RNA prob (20 50ng de her ihtiyaç) (80 ° C 5 dakika) ve hibridizasyon tamponu (ul 100 de ortalama gerekli)
13. Kuyulara prob ekleyin ve 55 az 48 saat inkübe ° C

3. GÜN

1. 4 x 5 dakika yıkayınız 55 ° C PHB
2. 55 PHB gece inkübe ° C

4. GÜN

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   • Antikor Blok Tamponu
2. PHB: 50:50 PBT 1 x 5 dakika yıkayın
3. PBT içinde 4 x 5 dakika yıkayın
4. 4 Blok Tampon 1 saat inkübe kanatları ° C
5. 4 geceleme anti-Kazı antikor 1:2000 dilüsyon kanatları inkübe ° C

5. GÜN

1. Aşağıdaki çözümleri hazırlayın:
   • Algılama Tampon
   • Gelişmekte olan Çözümü - ışığa karşı hassastır (folyo ile sarın)
2. Oda sıcaklığında PBT 3 x 5 dakika yıkayın
3. PBT yıkayın 7 x 5 dakika
4. Algılama Tampon kanatları iki kez durulayın
5. Çözüm Geliştirme 1 ml kanatları geliştirin gelişme zamanı her zaman kontrol edilmelidir gelişmekte kez aynı probları ve gelişmekte olan çözümü kullanırken bile değiştirebilirsiniz genellikle gecede aralıklarla kadar artırmaya sonra 5-10 dakika sonra kontrol edin ve. Plaka örnekleri kontrol ışığa maruz önlemek için folyo sarılı olmalıdır.
6. Gelişmekte olan Durdur Tampon beş kez durulayın
7. Kanatları Dağı.

Tartışmalar

Mevcut protokollerin optimizasyonu

Larva kanat disklerine yerinde döllemeler başarıyla Precis coenia kelebekler diskler kullanılarak yapılmıştır (Carroll ve ark 1994; Keys ve ark 1999; Weatherbee ve ark 1999). Protokolü larva kanat renklendirmeler Carroll Lab isteği üzerine ayrıntılı bir yazılı protokol adapte edilmiştir. Yapılan değişiklikler, larva ve pupa kanat dokular arasındaki farklılıkları barındırmak için hizmet vermektedir. Pupa hindwing diseksiyonlar sırasında peripodial membran kuyuları dahil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fix Buffer				4% Paraformaldehyde in PBS
PBT				0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution				2.5mg/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer				2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer				For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer				Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer				50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA
Anti-DIG	Ab	Roche Group	11 093 274 910	Alkaline Phosphatase conjugated
DIG Wash and Block Buffer Set		Roche Group	11 585 762 001
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium		Sigma-Aldrich	C0612	Mounting Medium