Dans le protocole in situ pour Wings Nymphe papillon utilisant ribosondes

Résumé

Afin d'examiner l'expression des gènes dans les tissus des pupes de l'aile Bicyclus anynana, nous présentons un protocole optimisé pour les hybridations in situ en utilisant des ribosondes. Nous fournissons aussi des directives pour l'optimisation de ce protocole pour l'utilisation dans les ailes des pupes de espèces de lépidoptères autres.

Résumé

Nous présentons ici, en format vidéo, un protocole pour les hybridations in situ dans les ailes des pupes de l'anynana papillon Bicyclus utilisant ribosondes. Hybridations in situ, un pilier de la biologie du développement, sont utiles pour étudier la répartition spatiale et temporelle de l'expression des gènes dans le développement de tissus au niveau de la transcription. Si des anticorps qui ciblent les produits de protéine de transcription des gènes n'ont pas encore été développée, et / ou il ya de multiples copies du gène d'une protéine particulière dans le génome qui ne peuvent pas être différenciés en utilisant des anticorps disponibles, situs peut être utilisé à la place. Alors une technique in situ pour les disques ailes larvaires ont été offerts à la communauté papillon pour plusieurs années, le protocole actuel a été optimisé pour les ailes plus grandes et plus fragiles chrysalide.

Protocole

JOUR 1

1. Préparer les solutions suivantes:
   • 10x PBS
   • 1x PBS
   • 1x PBT
   • ddH ₂ O
     • Ajouter DEPC pour un volume total de 0,1% et secouer vigoureusement solutions.
     • Autoclave.
   • Fix paraformaldéhyde à 4% - à l'aide de PBS-DEPC
   • Solution de protéinase K - Si un précipité apparaît, vortexer vigoureusement avant de retirer aliquote
   • Tampon d'arrêt Digestion
   • Tampon de préhybridation
   • 50:50 PBT: tampon de préhybridation
   • Tampon d'Hybridation
     • Les solutions doivent être conservés sans RNase. Utilisez soit verrerie qui a été cuit (4 heures à 250 ° C) ou en plastique jetables. Pipettes sérologiques sont très utiles pour la confection des solutions
2. Disséquer les ailes du temps mis en scène les pupes dans le PBS
3. Déplacer des ailes directement à Fix Buffer dans des puits de 24 plaques de culture bien à température ambiante
4. Fixer les disques pendant 2 heures
5. Laver 5 x 5 minutes en PBT
6. Incuber ailes pendant 3 minutes dans la protéinase K solution
7. Rincer 2 x dans le tampon d'arrêt Digestion
8. Laver 5 x 5 minutes en PBT
9. Lavez 2 x 5 minutes dans de 50:50 PBT: PHB
10. Lavez 1 x 10 minutes en PHB
11. Incuber dans PHB au moins 1 heure à 55 ° C.
12. Heat-dénaturent sonde ARN (20-50 ng par puits nécessaire) (80 ° C pendant 5 minutes) et ajouter à tampon d'hybridation (100 pi par puits nécessaire)
13. Ajouter la sonde de puits et incuber 48 heures à 55 ° C

JOUR 3

1. Lavez 4 x 5 minutes dans 55 ° C PHB
2. Incuber une nuit dans la PHB à 55 ° C

JOUR 4

1. Préparer les solutions suivantes:
   • Bloc tampon d'anticorps
2. Lavez 1 x 5 minutes dans de 50:50 PBT: PHB
3. Lavez 4 x 5 minutes en PBT
4. Ailes Incuber pendant 1 heure dans un tampon de bloc à 4 ° C
5. Incuber ailes dans une dilution 1:2000 d'anticorps anti-DIG nuit à 4 ° C

JOUR 5

1. Préparer les solutions suivantes:
   • Tampon de détection
   • Solution de développement - (envelopper dans du papier) sensible à la lumière
2. Laver 3 x 5 minutes en PBT à la température ambiante
3. Lavez 7 x 5 minutes dans de PBT
4. Rincer les ailes deux fois dans le tampon de détection
5. Développer des ailes dans 1 ml de solution de développement - le temps de développement doivent être surveillés à chaque fois - les temps de développement peuvent changer, même en utilisant les mêmes sondes et la solution de développement - généralement vérifier après 5-10 minutes et ensuite augmenter intervalles jusqu'à la nuit. Plaque doit être enveloppé dans une feuille de prévenir l'exposition de lumière quand il n'est pas la vérification des échantillons.
6. Rincer à cinq reprises en tampon d'arrêt de développement
7. Mont ailes.

Discussion

Optimisation des protocoles existants

Hybridations in situ sur des disques de l'aile des larves ont été réalisées avec succès en utilisant des disques à partir des papillons coenia Précis (Carroll et al, 1994;. Keys et al, 1999;. Weatherbee et al 1999).. Le protocole actuel a été adapté à partir d'un protocole écrit détaillé disponible sur demande auprès du laboratoire Carroll pour colorations aile larvaire. Les changements que nous a fait servir à tenir compte des différences entre les tissus des larves et ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fix Buffer				4% Paraformaldehyde in PBS
PBT				0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution				2.5mg/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer				2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer				For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer				Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer				50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA
Anti-DIG	Ab	Roche Group	11 093 274 910	Alkaline Phosphatase conjugated
DIG Wash and Block Buffer Set		Roche Group	11 585 762 001
Crystal Mount Aqueous Mounting Medium		Sigma-Aldrich	C0612	Mounting Medium