إنتاج استخراج الجنين الفرخ لزراعة الخلايا الجذعية العصبية الفئران كريست

Summary

لزراعة الخلايا الجذعية العصبية قمة (NCSC) في المختبر ، مطلوب المتوسطة الخاصة (NCSCM). جزء أساسي من NCSCM الفرخ هو استخراج الجنين (CEE). نحن هنا وصف دقيق تقنيات لإنتاج كمية من أوروبا الوسطى والشرقية إلى أقصى حد نوعية نقية وعالية ، بما في ذلك تفاصيل مثل العزلة ، والنقع ، الطرد المركزي ، وعمليات الترشيح.

Abstract

قمة العصبية تنشأ من الأديم الظاهر العصبي خلال مرحلة التطور الجنيني ، واستمرت لفترة مؤقتة فقط. التجارب المبكرة تثبيتهم بالفعل الخلايا الاصلية المحفزة لتكون جزءا لا يتجزأ من العرف العصبي ^1. Phenotypically ، وتعرف الخلايا الجذعية العصبية قمة (NCSC) في وقت واحد معربا عن P75 (منخفضة أفيني مستقبلات عامل نمو الأعصاب ، LNGFR) وSOX10 خلال هجرتهم من قمة العصبية ^2،3،4،5. يمكن لهذه الخلايا الاصلية تفرق في خلايا العضلات الملساء والخلايا أليفة الكروم ، الخلايا العصبية والخلايا الدبقية ، وكذلك الخلايا الصباغية والغضاريف والعظام ^6،7،8،9. لزراعة NCSC في المختبر ، وخاصة قمة العصبية الجذعية المتوسطة الخلية (NCSCM) مطلوب ^10. الجزء الأكثر تعقيدا في NCSCM هو إعداد استخراج الجنين الفرخ (CEE) الذي يمثل مصدرا أساسيا من عوامل النمو لNCSC فضلا عن أنواع أخرى من explants العصبية. المكونات الأخرى بجانب NCSCM CEE متاحة تجاريا. CCE المنتجة باستخدام معدات المختبر القياسية فإنه من الأهمية العالية لمعرفة التفاصيل الصعبة مثل العزلة ، والنقع ، الطرد المركزي ، وعمليات الترشيح. في هذا البروتوكول وصفنا تقنيات دقيقة لإنتاج كمية من أوروبا الوسطى والشرقية إلى أقصى حد نوعية نقية وعالية.

Protocol

الدولة من الكتاب والتي أجريت على حيوانات التجارب وفقا للمجتمعات الأوروبية توجيه المجلس (86/609/EEC) ، في أعقاب المبادئ التوجيهية لمعاهد الصحة القومية بشأن رعاية واستخدام الحيوانات لإجراءات تجريبية والانظمة التي وضعتها المؤسسات الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة (IACUC) في جامعة دويسبورغ إيسن (ألمانيا).

الجزء 1 : إعداد (لا يظهر على الفيديو)

إعداد المواد والحلول (قبل اتخاذ البيض من أصل الحاضنة)

• البيض يجب أن تكون المحتضنة في حاضنة مرطب لمدة 11 يوما على 37 درجة مئوية (100 درجة فهرنهايت).
• 70 ٪ رذاذ الايثانول ، لوحات نظيفة ، وملقط نظيفة دقيقة ، 4 درجات مئوية (40 درجة فهرنهايت) الباردة العقيمة DMEM على الجليد و 60 مل الحقن المعقمة
• 50 مل العقيمة أنابيب كورنينج يجب أن تكون نصف مملوءة 4 درجات مئوية الباردة DMEM لخلط الأجنة متآكلة في نسبة 1:1 (كتلة متآكلة : DMEM). حالما يتم أخذ البيض من أصل تشريح حاضنة لافراخ الدجاج يجب أن تكون بدأت.
• تعقيم أدوات تشريح في الأوتوكلاف أو في اليوم التشريح ، غمر الأدوات في الايثانول 70 ٪ لمدة 20 دقيقة.

الجزء 2 : تشريح لافراخ الدجاج (برهنت على الفيديو)

1. الرطب البيض المحتضنة مع رذاذ الايثانول 70 ٪ على الأقل 30 ثانية وتجفيفها بعناية مع مناشف ورقية نظيفة ناعمة بينما لا تهتز البيض بشكل مفرط.
   ملاحظة : من المستحسن عدم تشريح افراخ الدجاج أكثر من 60 في وقت واحد.
2. فتح البيض بعناية من قبل محطما ضد حافة حادة واخراج الجنين بحذر عدم تدمير أو صفار كيس الجنين الفرخ نفسه.
3. بحث عن بداية الحبل السري بسرعة وفتح التفاف واضحة من دون تدمير كيس المح أو أي سفن صغيرة. تشريح ثم الحبل السري مع ملقط نظيفة دقيقة.
4. يأخذ الجنين من كيس المح.
   ملاحظة : يجب قطع رأس الجنين بسرعة (لا يظهر في شريط الفيديو).
5. جمع الأجنة في الوسيلة الأساسية في الحد الأدنى من 4 درجات مئوية.

الجزء 3 : تعطين لافراخ الدجاج

1. أخذ حقنة من المكبس معقمة 60 مل.
2. نقل الأجنة حوالي 10 حقنة في واحدة 60 مليلتر.
3. وضع المكبس الخلفي بعناية في حقنة لكي لا تجازف بخسارة مادية متآكلة.
4. أضعف من خلال دفع المكبس إلى أسفل.
5. جمع الشامل في أنابيب متآكلة استعداد كورنينج نصف مليئة DMEM في نسبة 1:1 (كتلة متآكلة : DMEM). أجنة باستخدام 10 وبلغ حجم التداول حوالي 25 مل ويتم إنتاج.
6. ضع الخليط على شاكر لمدة 45 دقيقة على 4 درجات مئوية.

الجزء 4 : الطرد المركزي للجنين الفرخ -- DMEM تعليق

1. نقل الجنين الفرخ -- في أنابيب الطرد المركزي DMEM التعليق.
2. إضافة هيالورونيداز العقيمة في تركيز 1 ملغ 25 ملغ من الجنين.
3. أنابيب الطرد المركزي الفارغة بدقة متناهية.
   ملاحظة : يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة بحذر كما هو الطرد المركزي تعمل على سرعات عالية جدا بالقوة ز وأضرار مادية أو الطرد المركزي يمكن أن تحدث في حالة استخدام أنابيب غير متوازن. مع دقة عالية وزنها فقا آلة بشأن المناصب الثلاثة يجب أن تسلم بعد الفاصلة العشرية للجميع أنابيب من خلال تعديل كمية المفقودين مع DMEM.
4. خفض درجة حرارة جهاز الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
   ملاحظة : يجب أيضا أن يتم تخزين الدوار الطرد المركزي في غرفة التبريد أو الثلاجة طوال الليل.
5. الطرد المركزي 6 ساعات على الأقل لساعة. xgx 180،000 ملاحظة : للحصول على نتائج متفوقة بشأن فصل واحد من مراحل استخدام 266،000 xgx ح إذا كان ذلك ممكنا ، استخدم التكيف فراغ.

الجزء 5 : الترشيح لاستخراج الجنين الفرخ

بعد الطرد المركزي ، ويمكن لاحظت ثلاث مراحل : المرحلة العليا وسائل قذرة مع شظايا الدهنية ، وهي مرحلة واضحة في منتصف السائل وبيليه في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي. ملاحظة : المصافحة أو الانتقال السريع من الخليط بالطرد المركزي يجب أن يكون تجنب تماما ، لأن هذا من شأنه أن يدمر نتيجة للخطوة الطرد المركزي التي تفقد واضحة المرحلة السائلة المركزية.

ملاحظة : جميع الخطوات التالية التي يتعين القيام بها تحت ظروف معقمة باستخدام تدفق الهواء مقاعد البدلاء الصفحي :

1. ماصة المرحلة السائلة واضحة في نظام التصفية مع مسام 0.45 ميكرون. ثم التبديل على مضخة فراغ متصل.
   ملاحظة : لا تلمس بيليه في القاع. هذا من شأنه أن يؤدي إلى تلوث للاستخراج وجود انسداد في نظام التصفية.
2. نقل استخراج مسبقا في نظام التصفية مع مسام 0.22 ميكرون والتبديل على مضخة فراغ متصلا مرة أخرى.
3. قسامة الجنين بلغ استخراج الفرخفي أنابيب معقمة كورنينج 15 مل.
4. مخزن بسرعة aliquots في -80 درجة مئوية (-62 درجة فهرنهايت). ملاحظة : CEE الماضي لمدة تصل إلى سنتين إذا المخزنة في -80 درجة مئوية.

Discussion

ويستند هذا البروتوكول على إدخال تعديلات على الإجراءات التي تم وصفها في الماضي ^10،11. بالإضافة إلى المنشورات السابقة التي نعرضها هنا هي الخطوات الفردية المختلفة لعملية التوسع أكثر من ذلك. هذا يدعم مجرب مع تفاصيل مهمة ضمان اجراءات صحيحة ونتائج موثوق بها. كذلك ، عم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 days incubated chicken eggs	Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Alcoholic disinfection spray	Schülke Mayr GmbH
DMEMGlutamax	GIBCO, by Life Technologies
Syringe sterile (60 ml)	BD Biosciences
Tubes sterile (50; 15 ml)	Greiner Bio-One
Pipet tips sterile	Starlab GmbH
Hyaluronidase typeIV-S	Sigma-Aldrich
Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl)	Fisher Scientific
Pipettes sterile (25; 10; 5 ml)	Greiner Bio-One
Centrifuge L5-50	Rotor type Ti-45