Производство Чик извлечение эмбрионов для выращивания мышей нервных стволовых клеток Крест

Резюме

Чтобы вырастить нервного гребня стволовых клеток (NCSC) в пробирке, специальные среды (NCSCM) не требуется. Значительная часть NCSCM является куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ). Мы здесь описать точных методов для получения максимальной суммы чистого и высокого качества Центральной и Восточной Европы, в том числе детали, как изоляция, мацерации, центрифугирования и фильтрации процессов.

Аннотация

Нервного гребня возникает из-за нервно-эктодермы в период эмбриогенеза и сохраняется только на время. Первые эксперименты уже проверенные плюрипотентных клеток-предшественников, чтобы быть неотъемлемой частью нервного гребня ^1. Фенотипически, нервного гребня стволовых клеток (NCSC) определяются одновременно выразив p75 (низкий аффинных фактора роста нервов рецепторов, LNGFR) и SOX10 во время их миграции из нервного гребня ^2,3,4,5. Эти клетки-предшественники могут дифференцироваться в клетки гладкой мускулатуры, хромаффинных клеток, нейронов и глиальных клеток, а также меланоцитов, хрящевой и костной ^6,7,8,9. Чтобы вырастить NCSC в пробирке, специальные нервного гребня стволовых клеток среды (NCSCM) требуется ^10. Наиболее сложной частью NCSCM является подготовка куриного эмбриона экстракт (ЦВЕ), представляющий собой важный источник роста факторов NCSC, а также для других типов нейронных эксплантов. Другие ингредиенты NCSCM рядом с Центральной и Восточной Европы имеются в продаже. Производство CCE с использованием лабораторных стандартной комплектации он имеет большое значение, чтобы знать о сложных деталей, как изоляция, мацерации, центрифугирования и фильтрации процессов. В этом протоколе описываются точных методов для получения максимальной суммы чистого и высокого качества ЦВЕ.

протокол

Авторы утверждают, что эксперименты на животных были проведены в соответствии с Европейскими сообществами Директивы Совета (86/609/EEC), следующие руководящие принципы в отношении НИЗ уход и использование животных для экспериментальных процедур и правил, установленных Институциональные животных Уход и использование комитета (IACUC) в университете Дуйсбург-Эссен (Германия).

Часть 1: Настройка (не показано на видео)

ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛОВ И ПУТИ ИХ РЕШЕНИЯ (до принятия яйца из инкубатора)

• Яйца должны быть инкубировали во влажной инкубаторе в течение 11 дней при температуре 37 ° C (100 ° F).
• 70% этанола, спрей, чистые тарелки, точный чистый пинцет, 4 ° C (40 ° F) холодного стерильного DMEM на льду и 60 мл стерильные шприцы
• 50 мл стерильные пробирки Corning должны быть наполовину заполненной с 4 ° С холодным DMEM смешать вымоченных эмбрионов в соотношении 1:1 (вымоченных масса: DMEM). Как только яйца выводятся из рассечение инкубатор куриных эмбрионов должен быть запущен.
• Стерилизовать рассечение инструментов в автоклаве или в день вскрытия, погрузить инструменты в 70% этаноле в течение 20 минут.

Часть 2: Препарирование куриных эмбрионов (демонстрируется на видео)

1. Влажные инкубационных яиц с 70% этанола спрея в течение по крайней мере, 30 секунд и высушите их осторожно чистой мягкой салфеткой при этом не качая яйца чрезмерно.
   Примечание: Мы рекомендуем не рассекает более чем на 60 куриных эмбрионов одновременно.
2. Открытое яйца тщательно лихой против острого края и выньте эмбриона с осторожностью, не разрушая мешок желтка или куриного эмбриона себя.
3. Поиск начале пуповины быстро и открытых ясно упаковки, не разрушая мешок желтка или любой мало судов. Затем рассекают пуповину с точным чистым пинцетом.
4. Возьмите эмбриона из мешка желтка.
   Примечание: Эмбрионы должны быть обезглавленным быстро (не показано на видео).
5. Сбор эмбрионов в минимальной необходимой среде при температуре 4 ° C.

Часть 3: мацерация куриных эмбрионов

1. Возьмите поршень из 60 мл стерильного шприца.
2. Передача примерно 10 эмбрионов в одном 60 мл шприца.
3. Поместите поршень тщательно обратно в шприц, чтобы не потерять вымоченных материала.
4. Размочите, нажав на поршень.
5. Сбор вымоченных массу в подготовленные трубки Corning наполовину заполненной с DMEM в соотношении 1:1 (вымоченных масса: DMEM). Использование 10 эмбрионов объемом около 25 мл производится.
6. Поместите смесь в шейкере в течение 45 мин при 4 ° C.

Часть 4: Центрифугирование куриного эмбриона - DMEM Подвеска

1. Передача куриного эмбриона - DMEM суспензии в центрифугирования труб.
2. Добавить стерильной гиалуронидазы в концентрации 1 мг на 25 мг эмбриона.
3. Тара центрифугирования труб очень точно.
   Примечание: Этот шаг следует выполнять с осторожностью, так как центрифугирование запускается при очень высоких перегрузок и повреждения материала или центрифуги могут возникнуть при использовании несбалансированной труб. С высокой точностью весов соответствии отношении трех позиций после десятичной точки для всех труб должна быть получена путем корректировки недостающую сумму с DMEM.
4. Уменьшить температуру центрифуге до 4 ° C.
   Примечание: Также центрифугирования ротора должны храниться в холодильной камере или холодильнике в течение ночи.
5. Центрифуга 6 часов по крайней мере, 180,000 х ^ Х ч. Примечание: Для получения превосходных результатов в отношении разделения отдельных фаз использовать 266,000 х ^ Х ч. Если это возможно, использовать вакуум регулировки.

Часть 5: Фильтрация Извлечение куриного эмбриона

После центрифугирования, три фазы можно заметить: верхний темный жидкой фазы с жирными фрагменты, ясно жидкой фазы в середине и осадок на дне трубки центрифугирования. Примечание: встряхивания или оживленной перемещения центрифугировали смеси должна быть строго избегать, так как это разрушит результате центрифугирования шаг за потери ясно центральной жидкой фазы.

Примечание: Все следующие шаги должны быть выполнены в стерильных условиях с использованием ламинарного потока воздуха скамьи:

1. Внесите ясно жидкой фазы в фильтр с порами 0,45 мкм. Затем включите связано вакуумного насоса.
   Примечание: Не прикасайтесь гранул на дне. Это привело бы к загрязнению извлекать и блокирование системы фильтров.
2. Передача предварительно распакован в фильтр с порами 0,22 мкм и переключиться на подключенном вакуумный насос снова.
3. Алиготе достигнута экстракт куриного эмбрионав стерильные 15 мл Corning труб.
4. Быстро хранить аликвоты при -80 ° C (-62 ° F). Примечание: Центральной и Восточной Европе продлится до двух лет при условии хранения при температуре -80 ° C.

Обсуждение

Этот протокол основан на модификации процедуры, которые были описаны в прошлом ^10,11. В дополнение к бывшим публикациях мы здесь, показывают отдельные различные этапы процесса более расширены. Это подтверждает экспериментатор с важной детали обеспечения правильного разбирательс?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 days incubated chicken eggs	Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Alcoholic disinfection spray	Schülke Mayr GmbH
DMEMGlutamax	GIBCO, by Life Technologies
Syringe sterile (60 ml)	BD Biosciences
Tubes sterile (50; 15 ml)	Greiner Bio-One
Pipet tips sterile	Starlab GmbH
Hyaluronidase typeIV-S	Sigma-Aldrich
Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl)	Fisher Scientific
Pipettes sterile (25; 10; 5 ml)	Greiner Bio-One
Centrifuge L5-50	Rotor type Ti-45