المبادئ الأساسية لتنقية باستخدام السوائل فوق الحرجة الكروماتوجراف -- إعلان

Summary

المبادئ الأساسية لفصل مخاليط من مركبات باستخدام اللوني السائل فوق الحرج (SFC) مماثلة لأساسيات اللوني السائل التحضيرية.

Abstract

على الرغم من فوق الحرج اللوني السائل (SFC) ليست تقنية جديدة ، إعدادي SFC أصبح أكثر شعبية متزايدة مع التقدم في مجال البرمجيات ، والأجهزة والكيمياء. المبادئ الأساسية لعزل المركبات مع SFC مشابهة للقواعد الأساسية للواسعة النطاق اللوني السائل التحضيرية. في هذه الدراسة ، نحن لتوضيح تأثير معدل التدفق ، وانحلال العينة المذيبات ، والانتقائية العمود على عزل المركبات من الخليط. أعمدة السرير محملة الكثافة المثلى (OBD) التكنولوجيا ⁽¹⁾ والمطابقة مع الكيمياء ضمان قابلية سهلة ويمكن التنبؤ بها من النطاق الضيق إلى فصل أكبر التحضيرية.

Protocol

1. تحضير العينة

• مزيج مركب 1 : الكومارين ، ايبوبروفين ، وكاربامازيبين ؛ 20 ملغ / مل في كل من الميثانول
• مزيج مركب 2 : ايبوبروفين وكاربامازيبين ؛ 20 ملغ / مل في كل من الميثانول
• مزيج مركب 3 : ايبوبروفين وكاربامازيبين ؛ 20 ملغ / مل في كل DMSO (سلفوكسيد ثنائي ميثيل)
• مزيج مركب 4 : 10 ملغ / مل فينوبروفين ، 15 ملغ / مل كيتوبروفين ، 20 ملغ / مل فلافون ، 20 ملغ / مل ايبوبروفين ، و 20 ملغ / مل الكومارين في الميثانول

2. الشروط التجريبية

1. أجري التحليل اللوني على نظام أسلوب محطة مياه SFC.
   العمود : 2 - البلدي SFC Ethylpyridine العمود ، 5 ميكرون ، 4.6 × 150 مم ، الجزء رقم 186004937.
2. تم تنفيذ التحضيرية اللوني على الإعدادية ووترز 100 نظام الأشعة فوق البنفسجية SFC إخراج. الأعمدة :
   • SFC البلدي العمود OBD - 2 Ethylpyridine ، 5 ميكرون ، 19 × 150 مم ، الجزء رقم 186004945
   • OBD البلدي السيليكا SFC العمود ، 5 ميكرون ، 19 × 150 مم ، الجزء رقم 186004918
   • SFC البلدي العمود OBD - 2 Ethylpyridine ، 5 ميكرون ، 19 × 100 مم ، الجزء رقم 186004944
3. معلمات الطريقة الأخرى :
   • درجة الحرارة العمود : 40 درجة مئوية
   • Cosolvent : الميثانول
   • حجم الحقن ، ومعدل التدفق ، والتدرجات : أفاد في أرقام

3. ممثل النتائج

معدل التدفق

ويقتصر معدل التدفق المستخدمة في فصل LC التحضيرية من قبل عدد من العوامل بما في ذلك طول وقطر العمود ، وحجم الجسيمات ، والضغط الخلفي النظام. ثاني أكسيد الكربون المنخفضة اللزوجة ، والمكون الرئيسي للمرحلة المحمول في SFC ، وتمكن من استخدام معدلات التدفق من تلك التي تستخدم عادة في اللوني السائل. من الضغط الخلفي المرتبطة طول العمود أقل أيضا ، مما يعد استخدام الأعمدة لزيادة دقة. ارتفاع معدلات تدفق زيادة الإنتاجية عن طريق تقليل كمية من الوقت لاستكمال الانفصال. كما هو مبين في الشكل 1 ، والوضع الكروماتوغرافي هو نفسه في معدلات تدفق مختلفة شريطة أن المنحدر من التدرج في التغيير وأعرب في المائة في حجم العمود لا تزال مستمرة.. ويتم إنجاز ذلك عن طريق تقليل وقت التشغيل بنفس النسبة كما هو زيادة معدل التدفق.

حل عينة وتحميل المذيبات

عزل المركبات من الخلائط يتطلب أن تكون العينة للذوبان تماما قبل الحقن. والميثانول ، والأكثر شيوعا المشترك المذيبات في SFC ، لا solubilize جميع العينات في التركيزات العالية المطلوبة عادة لفصل إعدادي نموذجي. يمكن أن كميات كبيرة من المذيبات مثل الميثانول تحد من قدرة كتلة العمود وذلك بسبب الآثار التي يمكن أن المذيبات قوية تشوه اللوني. تم تصميم معدل حقن تيار ، التكوين القياسية على براءة اختراع من جميع النظم ووترز SFC الإعدادية ، للحد من تأثير هذه المذيبات. يستخدم ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) بشكل منتظم في المختبرات لتنقية solubilize العديد من أنواع مختلفة من المركبات. الشكلين 2 و 3 لتوضيح كيفية حقن DMSO في SFC يمكن أن يؤدي إلى ارتفاع التحميل ودقة أفضل للتطبيقات achiral مقارنة عينات حقنه في الميثانول.

ملاحظة : للحصول على التطبيقات مراوان ، وينبغي النظر بحذر DMSO كما يمكن أن تضر بشدة المغلفة مراوان المرحلة التقليدية الثابتة. إذا كان يجب أن تكون هناك حاجة للذوبان في العينة DMSO ، ينبغي اختيار عمود يجمد مراوان.

الانتقائية

في SFC ، يتم اختبار روتيني لتحديد عدة أعمدة الذي يوفر أفضل وشكل القرار الذروة للمكونات في الخليط. قرار جيد بين المركبات يؤدي إلى العزلة من المركبات المستهدفة مع درجة نقاوة عالية. في المثال أدناه ، العمود 2 - ethylpyridine يبين الفصل ممتازة لجميع المركبات الخمسة في خليط العينة. الخليط نفس العينة تحليلها على عمود السيليكا يظهر سوى ثلاث قمم المكون لأنه يحتوي على الانتقائية المختلفة. الكومارين والإيبوبروفين coelute بنحو 0.8 دقائق وفلافون وcoelute فينوبروفين في وقت لاحق قليلا. فلافون والإيبوبروفين أيضا تغيير النظام شطف على العمود السيليكا. كيتوبروفين جيدا من كل فصل من قمم أخرى في كلا العمودين.

التحجيم

عادة يتم تحليل عينة الخام مخاليط مع التدرج الفرز الذي يبدأ من نسبة منخفضة من المذيبات العضوية وينتهي عند نسبة أعلى من المذيبات العضوية في فترة زمنية قصيرة نسبيا. إذا كان يتم حلها بشكل جيد للمركبات ذات الأهمية ، قد يمكن تحجيمها التدرج مباشرة لتنقية. عندما تكون جميع المركبات أزل قبل عشر(ه) من إتمام الانحدار ويتم حلها بشكل كامل ، وتخفيض بسيط في طول التدرج هو مقبول. معدلات تدفق سريع المستخدمة في SFC جنبا إلى جنب مع التدرجات تعديل تقصير كبير في مجموع الوقت اللازم لتنقية المركبات المستهدفة.

فصل التوسع يتطلب مطابقة الكيمياء العمود وحجم الجسيمات ، وكذلك حقن كميات تحجيم مناسب والتدرجات. مياه معبأة التحضيرية الأعمدة SFC مع تقنية OBD ، وضمان الاستقرار ممتازة السرير والأداء مقارنة الأعمدة ووترز SFC التحليلية. معبأة OBD أعمدة السرير التحضيرية لكثافة المباراة التي تعادل نحو وثيق العمود التحليلية. هذا الإجراء مبتكرة تنتج الأعمدة تحضيري مع الاستقرار ممتازة ، واستنساخ ، والكفاءة.

وأجريت دراسة التحميل في نطاق ضيق لتحديد مدى يمكن تحميل كتلة العينة على العمود. والهدف هو تحقيق أقصى قدر من المشقة دون المساس القرار. القرار ذروة تحسن يؤدي إلى ارتفاع الأحمال وتحسين نقاء للمركبات معزولة. أعلى العمود تحميل يقلل من عدد من يدير المطلوبة للحصول على ما يكفي من المواد لإجراء التجارب اللاحقة. وصفت اللوني من الدراسة التحميل في الشكل 5. المحافظ 35 ميكرولتر يبين حجم الحقن قرار جيد بين جميع المركبات في المزيج وتحجيمها لاحقا لتشغيل التحضيرية على عمود كبير. تم حقن وحدة تخزين ما مجموعه 600 ميكرولتر على عمود 19 × 150 مم SFC التحضيرية. الشكل 6 يقارن به التدرج اللوني الصغيرة تعديل في الحمولة القصوى مع اللوني واسعة النطاق تستخدم لعزل. الانتقائية هي متطابقة ، عاملا حاسما عند استخدام اللوني التحليلية كأداة لعزل الكشفية والاختلاف في الوقت الاحتفاظ purification.The والقرار بين التحليلية وchromatograms التحضيرية يمكن أن تعزى إلى عوامل من بينها حجم ووضع نظام الحقن. على وجه الخصوص ، ويعمل على براءة اختراع معدل الدفق حقن * وضع لجميع النظم ووترز SFC التحضيرية ، والتقليل من تأثير المذيبات ، وبالتالي تحسين الإنتاجية والكفاءة.
* براءة الاختراع الأمريكية # 6576125

Discussion

• ويمكن تطبيق المبادئ الأساسية للاللوني السائل اللوني السائل فوق الحرج (SFC).
• يمكن تشغيل اللوني السائل فوق الحرج في معدلات التدفق المتزايد العزلة صنع أسرع وزيادة الإنتاجية.
• ويمكن حله مع عينات محدودة للذوبان في ثنائي ميثيل سلفوكسيد وتنقيتها باستخدام SFC. باستخدام عينة DMSO عن حل يجعل عملية تنقية أسهل عن طريق الحد من عدم اليقين المرتبط الذوبان في العينة.
• ويمكن تحسين القرار وتحميل العينات الذائبة في DMSO بالمقارنة مع نفس العينات الذائبة في الميثانول. أفضل نموذج القرار يؤدي إلى المنتجات مع ارتفاع النقاء. أعلى تحميل يحسن كفاءة عملية التنقية.
• الانتقائية العمود آثار فصل مكونات الخليط. فرز أعمدة مختلفة مع التدرجات سريع يؤدي إلى اتخاذ قرار حول أي عمود التحضيرية لاستخدامها لعزل المركبات الموجودة في العينة.
• القدرة على النطاق بين التحليلية وأعمدة التحضيرية OBD يؤدي إلى فصل مماثلة على مستويات كل صغيرة وكبيرة ، شريطة أن يتم تحجيم حجم الحقن ، والمنحدر ، والوقت بشكل صحيح التدرج والكيمياء وحجم الجسيمات تظل ثابتة. التدرجية العمود يزيل الغموض في تحديد الذروة ، مما يسهل عملية تنقية أعلى كفاءة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Method Station SFC System	Waters	More information available at www.waters.com	Analytical SFC system
SFC-UV Prep 100	Waters	More information available at www.waters.com	Preparative SFC System
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004937	Analytical SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004945	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004918	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column	Waters	186004944	Preparative SFC Chromatography Column