העקרונות הבסיסיים של טיהור באמצעות כרומטוגרפיה לנוזל סופר - פרסומת

Summary

עקרונות יסוד להפרדת תרכובות מתערובות באמצעות כרומטוגרפיה לנוזל סופר (SFC) דומים יסודות כרומטוגרפיה נוזלית preparative.

Abstract

למרות כרומטוגרפיה לנוזל סופר (SFC) אינה שיטה חדשה, preparative SFC הופך יותר ויותר פופולרי יותר עם התקדמות תוכנה מכשור, וכימיה. עקרונות יסוד לבידוד תרכובות עם SFC דומים כללי היסוד של כרומטוגרפיה preparative בקנה מידה גדול נוזלי. במחקר זה, אנו ממחישים את השפעת קצב הזרימה, פירוק מדגם ממס, סלקטיביות טור על הבידוד של תרכובות מתערובת. עמודות ארוז עם צפיפות מיטה אופטימום (OBD) טכנולוגיה ¹ ועם כימיה התאמת להבטיח הרחבה קל וצפוי של סולם קטן יותר הפרדות preparative.

Protocol

1. לדוגמא הכנה

• מתחם תערובת 1: coumarin, איבופרופן, ו קרבמזפין, 20 מ"ג / מ"ל ​​כל מתנול
• מתחם תערובת 2: איבופרופן קרבמזפין, 20 מ"ג / מ"ל ​​כל מתנול
• מתחם תערובת 3: איבופרופן קרבמזפין, 20 מ"ג / מ"ל ​​כל DMSO (sulfoxide דימתיל)
• מתחם תערובת 4: 10 מ"ג / מ"ל ​​Fenoprofen, 15 מ"ג / מ"ל ​​Ketoprofen, 20 מ"ג / מ"ל ​​Flavone, 20 מ"ג / מ"ל ​​איבופרופן, ו 20 מ"ג / מ"ל ​​coumarin של מתנול

2. ניסיוני תנאי

1. אנליטי כרומטוגרפיה בוצעה על מערכת תחנת שיטת ווטרס SFC.
   טור: Viridis SFC 2-Ethylpyridine טור, 5 מיקרומטר, 4.6 x 150 מ"מ, חלק מספר 186004937.
2. Preparative כרומטוגרפיה בוצעה על מערכת Prep ווטרס SFC 100 UV בימוי. עמודות:
   • Viridis SFC 2-Ethylpyridine טור OBD, 5 מיקרומטר, 150 x 19 מ"מ, מספר חלק 186004945
   • Viridis OBD עמודה SFC סיליקה, 5 מיקרומטר, 150 x 19 מ"מ, מספר חלק 186004918
   • Viridis SFC 2-Ethylpyridine טור OBD, 5 מיקרומטר, 100 x 19 מ"מ, מספר חלק 186004944
3. שיטה פרמטרים אחרים:
   • טמפרטורה טור: 40 ° C
   • מתנול: Cosolvent
   • נפח הזרקה, ספיקה, והדרגות: מדווחות במספרים

3. נציג תוצאות

קצב הזרימה

קצב זרימת בשימוש הפרדות preparative LC מוגבלת על ידי מספר גורמים, כולל אורך ו קוטר של הטור, גודל החלקיקים ואת backpressure המערכת. צמיגות נמוכה פחמן דו חמצני, המרכיב העיקרי של השלב ניידים SFC, מאפשרת את השימוש ספיקות גבוהות יותר מאלה המשמשים בדרך כלל כרומטוגרפיה נוזלית. Backpressure הקשורים אורך הטור הוא גם נמוך יותר, המאפשר שימוש של עמודות יותר כדי להגדיל את הרזולוציה. ספיקה גבוהה להגדיל את התפוקה על ידי הפחתת כמות של זמן כדי להשלים ההפרדה. כפי שמוצג באיור 1, הפרופיל chromatographic זהה ברמות ספיקה שונה ובלבד שיפוע שיפוע לידי ביטוי השינוי אחוזים נפח הטור נשאר קבוע .. מטרה זו מושגת על ידי הפחתת הזמן לרוץ בשיעור זהה את קצב הזרימה הוא גדל.

לדוגמה פירוק וטעינה מרכך

בידוד תרכובות מתערובות דורש כי המדגם להיות מסיס לחלוטין לפני הזריקה. מתנול, הנפוצים ביותר שיתוף ממס ב SFC, לא solubilize כל דגימות על ריכוזים גבוהים נדרש בדרך כלל טיפוסי הפרדות preparative. כמויות גדולות של ממיסים כמו מתנול יכול להגביל את היכולת של מסה הטור בשל תופעות ממס חזק שיכול לעוות את כרומטוגרפיה. הנחל משנה זריקה, פטנט התצורה הסטנדרטי של כל הכנה מערכות ווטרס SFC, נועדה להפחית את האפקט הזה ממס. דימתיל sulfoxide (DMSO) משמש באופן קבוע במעבדות טיהור solubilize הרבה סוגים שונים של תרכובות. איורים 2, 3 להמחיש עד כמה זריקות DMSO ב SFC יכול לגרום העמסה גבוהה רזולוציה טובה יותר עבור יישומים achiral לעומת דגימות מוזרק מתנול.

הערה: לקבלת יישומים כיראליות, זהירות צריך להיחשב DMSO יכול לפגוע קשות שלב המסורתית מצופה נייח כיראליות. אם DMSO צריך להידרש מסיסות המדגם, טור כיראלי משותקת יש לבחור.

בררנות

ב SFC, מספר עמודות נבדקים באופן שגרתי כדי לקבוע אשר מספק את הפתרון הטוב ביותר ובצורה שיא עבור רכיבים בתערובת. רזולוציה טובה בין תרכובות מוביל isolations של תרכובות מטרה עם טוהר גבוהה. בדוגמה הבאה, העמודה 2-ethylpyridine מראה הפרדה מעולה של כל חמשת תרכובות בתערובת המדגם. תערובת מדגם זהה לנתח על עמודה סיליקה מראה רק שלוש פסגות רכיב כי יש לו סלקטיביות שונה. Coumarin ואיבופרופן coelute בערך 0.8 דקות flavone ו fenoprofen coelute מעט מאוחר יותר. Flavone ואיבופרופן גם לשנות את סדר elution על הטור סיליקה. Ketoprofen היטב להפריד בין כל הפסגות האחרות הן על עמודות.

דרוג

תערובות מדגם גולמי מנותחים בדרך כלל עם שיפוע הקרנה שמתחיל מ - אחוז נמוך של ממיס אורגני ומסתיים אחוז גבוה יותר של ממיס אורגני תוך זמן קצר יחסית. אם תרכובות עניין נפתרות היטב, שיפוע עשוי להיות מדורגים ישירות לטיהור. כאשר תרכובות כל elute לפני ההשלמת הדואר של שיפוע והם נפתרה במלואה, ירידה פשוטה אורך השיפוע מקובל. שיעורי זרימה מהירה בשימוש SFC בשילוב עם מילויים שונה משמעותית לקצר את הזמן הנדרש לטיהור מוחלט של תרכובות מטרה.

הפרדות קנה מידה מחייב התאמת כימיה עמודה גודל החלקיקים וכן כרכים הזרקת מדורגים בהתאם והדרגות. ווטרס preparative עמודות SFC עמוסים טכנולוגיה OBD, הבטחת יציבות המיטה מעולה וביצועים דומים ווטרס עמודות אנליטי SFC. OBD עמודות preparative ארוזים לישון בצפיפות אשר תואם את הטור אנליטית המקבילה. הליך חדשני מייצרת עמודות preparative עם יציבות reproducibility מעולה, ויעילות.

המחקר טוען מתבצעת בקנה מידה קטן כדי לקבוע כמה המונית מדגם ניתן לטעון על הטור. המטרה היא למקסם את העומס מבלי להתפשר על הרזולוציה. רזולוציה משופרת שיא מוביל המון גבוה וטוהר טוב יותר עבור תרכובות מבודדות. טעינת עמודה גבוהה מפחיתה את מספר ריצות נדרש לקבלת חומר די לניסויים הבאים. כרומטוגרפיה מן המחקר טוען מתואר באיור 5. נפח שמרנית 35 הזרקה μL מציג רזולוציה טובה בין כל התרכובות בתערובת והיא מדורגים לאחר מכן לטווח preparative על העמודה גדול. בהיקף כולל של 600 μL היה מוזרק על 19 x 150 מ"מ טור SFC preparative. איור 6 משווה את כרומטוגרפיה באמצעות צבע שונה בקנה מידה קטן בעומס המקסימלי עם כרומטוגרפיה בקנה מידה גדול המשמש לבידוד. הסלקטיביות היא זהה, גורם קריטי בעת שימוש כרומטוגרפיה אנליטית ככלי צופיות עבור בידוד הבדלים purification.The בזמן שימור ברזולוציה בין אנליטיות preparative chromatograms ניתן לייחס גורמים שונים, לרבות אמצעי אחסון של המערכת למצב זריקה. בפרט, המגביל פטנט זרם הזרקה * מצב מועסק לכל preparative מערכות ווטרס SFC, למזער את השפעת הממס ולכן שיפור התפוקה והיעילות.
* פטנט אמריקאי # 6576125

Discussion

• העקרונות הבסיסיים של כרומטוגרפיה נוזלית ניתן ליישם כרומטוגרפיה לנוזל סופר (SFC).
• כרומטוגרפיה נוזל סופר קריטי ניתן לרוץ בקצב זרימה מוגברת עושה isolations מהר יותר והעלאת התפוקה.
• דוגמאות עם מסיסות מוגבלת יכול להיות מומס sulfoxide דימתיל וטיהר באמצעות SFC. שימוש DMSO לפירוק מדגם הופך את תהליך טיהור קל יותר על ידי צמצום חוסר הוודאות הקשורים מסיסות המדגם.
• החלטה וטעינה של דגימות מומס DMSO ניתן לשפר לעומת דגימות אותו מומס מתנול. רזולוציה טובה יותר מדגם מוביל מוצרים עם טוהר גבוה. העמסה גבוהה משפרת את היעילות של תהליך טיהור.
• הסלקטיביות טור משפיע על הפרדת מרכיבי התערובת. הקרנת עמודות שונות עם מילויים מהיר מוביל החלטה על איזו עמודה preparative להשתמש עבור בידוד תרכובות במדגם.
• היכולת בקנה מידה בין אנליטיות preparative עמודות OBD מוביל הפרדות זהה בשני סולמות קטנים וגדולים, ובלבד נפח הזרקה, מדרון, שיפוע וזמן הם מדורגים נכון את הכימיה ואת גודל החלקיקים נשארים קבועים. מדרגיות טור מסיר את אי הוודאות זיהוי השיא, ובכך להקל על תהליך יעילות גבוהה יותר לטיהור.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Method Station SFC System		Waters	More information available at www.waters.com	Analytical SFC system
SFC-UV Prep 100		Waters	More information available at www.waters.com	Preparative SFC System
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004937	Analytical SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004945	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004918	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column		Waters	186004944	Preparative SFC Chromatography Column