Princípios Básicos para Utilização Purificação Cromatografia Supercrítica - PROPAGANDA

Resumo

Princípios básicos para a separação de compostos a partir de misturas utilizando cromatografia com fluido supercrítico (SFC) são semelhantes aos fundamentos da cromatografia preparativa líquido.

Resumo

Apesar de cromatografia com fluido supercrítico (SFC) não é uma nova técnica, preparativa SFC está se tornando cada vez mais popular com os avanços em software, instrumentação e química. Princípios básicos para isolar compostos com SFC são semelhantes às regras fundamentais de grande escala cromatografia líquida preparativa. Neste estudo, ilustramos o efeito da taxa de fluxo, a dissolução da amostra de solvente e seletividade coluna sobre o isolamento de compostos de uma mistura. Colunas empacotadas com Densidade Cama Optimum (OBD) Tecnologia ¹ e com a química correspondência garantir a escalabilidade fácil e previsível a partir da pequena escala para separações maiores preparativa.

Protocolo

1. Preparação da Amostra

• Mistura composto 1: A cumarina, Ibuprofen, e carbamazepina; 20 mg / mL em metanol cada
• Mistura composto 2: Ibuprofeno e carbamazepina; 20 mg / mL em metanol cada
• Mistura composto 3: Ibuprofeno e carbamazepina; 20 mg / mL em cada DMSO (Dimetil sulfóxido)
• Mistura composta 4: 10 mg / mL fenoprofeno, 15 mg / mL cetoprofeno, 20 mg / mL Flavone, 20 mg / mL Ibuprofen, cumarina e 20 mg / mL em metanol

2. Condições experimentais

1. Cromatografia analítica foi realizada em um método de Sistema da Estação de Águas SFC.
   Coluna: Viridis SFC 2-Ethylpyridine coluna, 5 mm, 4,6 x 150 mm, Número da peça de 186.004.937.
2. Cromatografia preparativa foi realizada em um Prep Waters Sistema UV 100 SFC Direção. Colunas:
   • Viridis SFC 2-Ethylpyridine coluna OBD, 5 mm, 19 x 150 mm, Número da peça de 186004945
   • Viridis SFC OBD coluna de sílica, 5 mm, 19 x 150 mm, Número da peça de 186004918
   • Viridis SFC 2-Ethylpyridine coluna OBD, 5 mm, 19 x 100 mm, Número da peça de 186004944
3. Outros Parâmetros do método:
   • Temperatura da coluna: 40 ° C
   • Metanol: co-solvente
   • Volume de injeção, vazão e Gradientes: Relatado em números

3. Resultados representante

Vazão

A vazão utilizada nas separações preparativas LC é limitado por uma série de fatores, incluindo o comprimento eo diâmetro da coluna, o tamanho das partículas, ea contrapressão do sistema. Dióxido de carbono de baixa viscosidade, o principal componente da fase móvel na SFC, permite o uso de maiores taxas de fluxo do que aqueles geralmente utilizados em cromatografia líquida. A contrapressão associados com comprimento de coluna também é menor, permitindo o uso de colunas mais para aumentar a resolução. Maiores taxas de fluxo de aumentar o rendimento, reduzindo a quantidade de tempo para completar uma separação. Conforme mostrado na Figura 1, o perfil cromatográfico é o mesmo em taxas de fluxo diferentes, desde que a inclinação do gradiente expresso em variação percentual por volume coluna permanece constante .. Isto é conseguido, diminuindo o tempo de execução na mesma proporção que a taxa de fluxo é aumentado.

Dissolução da amostra e solvente Loading

Isolar os compostos a partir de misturas exige que a amostra ser completamente solúveis antes da injeção. Metanol, o mais comum co-solvente na SFC, não solubilizar todas as amostras nas concentrações elevadas geralmente necessária para separações típico preparativa. Grandes volumes de solventes como o metanol pode limitar a capacidade de massa da coluna, devido a fortes efeitos de solvente que pode distorcer a cromatografia. Modificador de injeção de fluxo, a configuração padrão de todos os sistemas patenteados Waters prep SFC, foi projetado para reduzir este efeito solvente. Dimetil sulfóxido (DMSO) é utilizado regularmente em laboratórios de purificação para solubilizar muitos tipos diferentes de compostos. Figuras 2 e 3 ilustram como injeções DMSO em SFC pode resultar em maior carga e melhor resolução para aplicações aquiral, em comparação com amostras injetadas em metanol.

Nota: Para aplicações quiral, o cuidado deve ser considerado como DMSO pode danificar seriamente a tradicional fase quiral estacionária revestido. Se DMSO deve ser necessário para a solubilidade da amostra, uma coluna quiral imobilizado deve ser selecionada.

Seletividade

Em SFC, várias colunas são rotineiramente testados para determinar que fornece a melhor resolução e formato de pico para os componentes em uma mistura. Boa resolução entre os compostos leva ao isolamento de compostos alvo com elevado grau de pureza. No exemplo abaixo, a coluna 2-ethylpyridine mostra uma excelente separação de todos os cinco compostos na mistura da amostra. A mistura mesma amostra analisada em uma coluna de sílica mostra apenas três picos componente porque ele tem uma seletividade diferente. Cumarina e ibuprofeno coelute em cerca de 0,8 minutos e flavona e fenoprofeno coelute um pouco mais tarde. Flavona e ibuprofeno também alterar a ordem de eluição na coluna de sílica. Cetoprofeno é bem separada de todos os outros picos em ambas as colunas.

Dimensionamento

Misturas de amostra bruto geralmente são analisados ​​com um gradiente de triagem, que começa a partir de uma baixa percentagem de solvente orgânico e termina em um maior percentual de solvente orgânico em um tempo relativamente curto. Se os compostos de interesse são bem resolvidas, o gradiente pode ser escalado diretamente para a purificação. Quando todos os compostos eluir antes ªconclusão e do gradiente e são totalmente resolvido, uma simples redução no comprimento do gradiente é aceitável. As taxas de fluxo rápido usado em SFC combinado com gradientes modificada encurtar consideravelmente o tempo total necessário para a purificação dos compostos alvo.

Separações escala requer correspondência química coluna e tamanho de partícula, assim como volumes de injeção escala apropriada e gradientes. Colunas Waters preparativa SFC são embalados com Tecnologia OBD, assegurando a estabilidade excelente cama e um desempenho comparável às colunas Waters analítica SFC. Colunas OBD preparativa são embalados para a cama densidades que se aproximam da coluna equivalente analítica. Este procedimento inovador produz colunas preparativas com excelente estabilidade, reprodutibilidade e eficiência.

Um estudo de carga é realizada em pequena escala para determinar a quantidade de massa da amostra pode ser carregada na coluna. O objetivo é maximizar a carga sem comprometer a resolução. Resolução melhorada de pico leva para cargas mais altas e melhor de pureza dos compostos isolados. Carregamento maior coluna reduz o número de execuções necessárias para obtenção de material suficiente para os experimentos subseqüentes. A cromatografia a partir do estudo de carga é mostrada na Figura 5. O conservador volume de injeção 35 mL mostra boa resolução entre todos os compostos na mistura e é posteriormente escalado para a corrida preparativa em coluna grande. Um volume total de 600 mL foi injetada na 19 150 mm x coluna preparativa SFC. Figura 6 compara a cromatografia utilizando o gradiente de pequena escala modificada com a carga máxima com a cromatografia em larga escala usada para o isolamento. A seletividade é idêntica, um fator crítico quando se utiliza cromatografia analítica como uma ferramenta de aferição para o isolamento e as diferenças purification.The no tempo de retenção e resolução entre a analítica e preparativa cromatogramas podem ser atribuídas a fatores incluindo o volume do sistema e modo de injeção. Em particular, o patenteado modificador de fluxo * O modo de injeção é utilizado para todos os sistemas Waters preparativa SFC, minimizando o efeito de solventes e, portanto, melhorar a produtividade e eficiência.
* EUA Patente # 6576125

Discussão

• Os princípios básicos de cromatografia líquida pode ser aplicada a cromatografia com fluido supercrítico (SFC).
• Cromatografia com fluido supercrítico pode ser executado em taxas de fluxo aumentou fazer isolamentos mais rápido e aumentando o rendimento.
• Amostras com solubilidade limitada pode ser dissolvida em dimetil sulfóxido e purificado usando SFC. Usando DMSO para a dissolução da amostra torna mais fácil o processo de purificação através da redução da incerteza associada com a solubilidade da amostra.
• Resolução e carregamento de amostras dissolvidas em DMSO pode ser melhorado quando comparado com as mesmas amostras dissolvidas em metanol. Melhor resolução da amostra leva a produtos com maior pureza. Maior carga melhora a eficiência do processo de purificação.
• Seletividade coluna impactos da separação dos componentes da mistura. Triagem diferentes colunas com gradientes rápido leva a uma decisão sobre qual coluna preparativa de usar para isolar os compostos na amostra.
• A capacidade de escala entre analítica e preparativa colunas OBD leva a separações idênticos em ambas as escalas pequenas e grandes, desde que o volume de injeção, inclinação e tempo de gradiente são dimensionados corretamente e da química e tamanho de partícula permanecem constantes. Escalabilidade coluna remove a incerteza na identificação de pico, facilitando assim a maior eficiência de processo de purificação.

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Method Station SFC System		Waters	More information available at www.waters.com	Analytical SFC system
SFC-UV Prep 100		Waters	More information available at www.waters.com	Preparative SFC System
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004937	Analytical SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004945	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004918	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column		Waters	186004944	Preparative SFC Chromatography Column