Principi di base per la purificazione mediante cromatografia fluido supercritico - PUBBLICITA '

Riepilogo

Principi di base per la separazione di composti da miscele di liquidi mediante cromatografia supercritica (SFC) sono simili ai fondamenti della cromatografia liquida preparativa.

Abstract

Anche se cromatografia fluido supercritico (SFC) non è una nuova tecnica, preparativa SFC sta diventando sempre più popolare con i progressi nella strumentazione, del software e della chimica. Principi fondamentali per isolare i composti con SFC sono simili alle regole fondamentali per la grande cromatografia liquida preparativa. In questo studio, abbiamo illustrare l'effetto di portata, di dissoluzione del campione solvente e selettività colonna l'isolamento di composti da una miscela. Colonne a riempimento con densità ottimale Letto (OBD) Tecnologia ¹ e con la chimica di corrispondenza garantire scalabilità facile e prevedibile dalla scala piccoli ai più grandi separazioni preparative.

Protocollo

1. Preparazione del campione

• Composto Miscela 1: cumarina, ibuprofene, e carbamazepina; 20 mg / ml ciascuno in metanolo
• Miscela composta 2: Ibuprofene e carbamazepina; 20 mg / ml ciascuno in metanolo
• Miscela composta 3: Ibuprofene e carbamazepina; 20 mg / mL ciascuno in DMSO (dimetil solfossido)
• Miscela composta 4: 10 mg / mL Fenoprofen, 15 mg / ml ketoprofene, 20 mg / mL Flavone, 20 mg / ml ibuprofene, e 20 mg / mL cumarina in metanolo

2. Condizioni sperimentali

1. Analitici cromatografia è stata eseguita su una stazione Metodo sistema Waters SFC.
   Colonna: Viridis SFC 2-Ethylpyridine colonna, 5 micron, 4,6 x 150 mm, Codice 186004937.
2. Cromatografia preparativa è stata effettuata su un Prep Waters 100 Sistema UV SFC Diretto. Le Colonne:
   • Viridis SFC 2-Ethylpyridine OBD colonna, 5 micron, 19 x 150 mm, Part Number 186004945
   • Viridis SFC OBD colonna di silice, 5 micron, 19 x 150 mm, Part Number 186004918
   • Viridis SFC 2-Ethylpyridine OBD colonna, 5 micron, 19 x 100 mm, Part Number 186004944
3. Parametri Metodo altri:
   • Colonna Temperatura: 40 ° C
   • Cosolvente: Metanolo
   • Volume di iniezione, portata, e gradienti: Riportato in cifre

3. Rappresentante Risultati

Portata

La portata utilizzata in preparativa separazioni LC è limitato da una serie di fattori, tra cui la lunghezza e il diametro della colonna, la dimensione delle particelle, e la contropressione del sistema. Bassa viscosità anidride carbonica, il principale componente della fase mobile in SFC, consente l'utilizzo di portate superiori a quelli generalmente utilizzati in cromatografia liquida. La contropressione associati lunghezza della colonna è anche più bassa, consentendo l'utilizzo di più colonne per aumentare la risoluzione. Portate superiori aumentare il throughput riducendo la quantità di tempo per completare una separazione. Come mostrato nella Figura 1, il profilo cromatografico è lo stesso a portate diverse a condizione che la pendenza del gradiente espressa in variazione percentuale per volume colonna rimane costante .. Questo si ottiene riducendo la fase di esecuzione nella stessa proporzione la portata è aumentata.

Scioglimento del campione e caricamento di solventi

Isolare composti da miscele richiede che il campione sia completamente solubile prima dell'iniezione. Metanolo, il più comune co-solvente in SFC, non solubilizzare tutti i campioni per le concentrazioni elevate di solito richiesto per le tipiche separazioni preparative. Grandi volumi di solventi come il metanolo può limitare la capacità di massa della colonna a causa di forti effetti di solventi che possono distorcere la cromatografia. Flusso di iniezione modificatore, la configurazione standard brevettato di tutti i sistemi di preparazione Waters SFC, è stato progettato per ridurre questo effetto solvente. Dimetil solfossido (DMSO) è utilizzato regolarmente nei laboratori di purificazione per solubilizzare diversi tipi di composti. Figure 2 e 3 illustrano come iniezioni di DMSO in SFC può risultare in un carico più elevato e una migliore risoluzione per applicazioni achirali rispetto ai campioni iniettati in metanolo.

Nota: Per le applicazioni chirali, la cautela dovrebbe essere considerato come DMSO può danneggiare gravemente un tradizionale rivestimento fase stazionaria chirale. Se DMSO dovrebbe essere richiesta per solubilità del campione, una colonna chirale immobilizzato deve essere selezionato.

Selettività

In SFC, più colonne sono regolarmente testati per determinare quale fornisce la migliore risoluzione e la forma di picco per i componenti in una miscela. Buona risoluzione tra composti porta ad isolamenti di composti target con elevata purezza. Nell'esempio sotto riportato, il 2-ethylpyridine colonna mostra separazione eccellente di tutti e cinque composti nella miscela campione. La miscela stesso campione analizzato in una colonna di silice mostra solo tre picchi componente perché ha una selettività diversa. Coeluiscono cumarina e ibuprofene in circa 0,8 minuti e flavone e fenoprofen coeluiscono leggermente più tardi. Flavone e ibuprofene anche cambiare ordine di eluizione su colonna di silice. Ketoprofene è ben separato da tutte le altre cime su entrambe le colonne.

Scaling

Miscele campione di greggio sono solitamente analizzati con un gradiente di screening che parte da una bassa percentuale di solventi organici e finisce in una percentuale più alta di solventi organici in un tempo relativamente breve. Se i composti di interesse sono ben risolto, il gradiente può essere scalato direttamente per la purificazione. Quando tutti i composti prima di eluire °completamento e del gradiente e sono completamente risolti, una semplice riduzione della lunghezza del gradiente è accettabile. Le portate veloce SFC utilizzata in combinazione con pendenze modificato notevolmente ridurre il tempo totale necessario per la purificazione di composti target.

Separazioni di scala richiede corrispondenza chimica colonna e dimensione delle particelle, ei volumi di iniezione, le scalate e le sfumature. Acque preparative colonne SFC sono confezionati con la tecnologia OBD, assicurando una stabilità eccellente letto e prestazioni paragonabili a Waters analitico colonne SFC. OBD colonne preparative sono imballati a letto densità che corrisponde da vicino la colonna equivalente analitica. Questa procedura innovativa produce colonne preparative con eccellente stabilità, riproducibilità ed efficienza.

Uno studio di carico viene eseguita a piccola scala per determinare la quantità di massa del campione può essere caricato sulla colonna. L'obiettivo è quello di massimizzare il carico senza compromettere la risoluzione. Migliore risoluzione di picco porta a carichi più elevati e migliori la purezza dei composti isolati. Carico della colonna maggiore riduce il numero di corse necessarie per ottenere abbastanza materiale per esperimenti successivi. La cromatografia dallo studio di carico è mostrata in Figura 5. Il volume di iniezione conservativa 35 microlitri mostra una buona risoluzione tra tutti i composti nella miscela e successivamente viene scalato per la corsa preparative sulla colonna di grandi dimensioni. Un volume totale di 600 microlitri è stato iniettato sul x 19 150 mm di colonna preparativa SFC. Figura 6 confronta la cromatografia utilizzando il gradiente di piccola scala modificata a pieno carico con la cromatografia su larga scala utilizzata per l'isolamento. La selettività è identica, un fattore critico quando si usa la cromatografia analitica come strumento di scouting per l'isolamento e le differenze purification.The in tempo di ritenzione e risoluzione tra i analitica e preparativa cromatogrammi può essere attribuito a fattori tra cui il volume del sistema e la modalità di iniezione. In particolare, il modificatore di flusso brevettati * iniezione modalità è impiegata per tutti i sistemi SFC preparativa Waters, minimizzando l'effetto solvente e quindi migliorare la produttività ed efficienza.
* US Patent # 6576125

Discussione

• I principi fondamentali della cromatografia liquida può essere applicata a cromatografia a fluido supercritico (SFC).
• Cromatografia a fluido supercritico può essere eseguito a velocità maggiore flusso isolamenti rendendo più veloce e aumentare il throughput.
• I campioni con limitata solubilità può essere sciolto in dimetilsolfossido e purificate utilizzando SFC. Utilizzando DMSO per la dissoluzione del campione rende il processo di purificazione più semplice, riducendo l'incertezza associata con la solubilità del campione.
• Risoluzione e il caricamento di campioni sciolti in DMSO può essere migliorata rispetto a gli stessi campioni disciolto in metanolo. Risoluzione di campionamento consente di ottenere prodotti migliori con una maggiore purezza. Maggiore carico migliora l'efficienza del processo di depurazione.
• Selettività colonna impatti la separazione dei componenti della miscela. Screening diverse colonne con gradienti veloce porta ad una decisione su quale colonna preparativa da utilizzare per isolare i composti presenti nel campione.
• La possibilità di scalare tra analitica e preparativa colonne OBD porta a separazioni identico da entrambe le scale piccole e grandi, a condizione che il volume di iniezione, pendenza, dislivello e il tempo vengono scalati correttamente e la chimica e la dimensione delle particelle rimangono costanti. Scalabilità colonna elimina l'incertezza nell'identificazione di punta, agevolando in tal modo una maggiore efficienza processo di purificazione.

Materiali

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Method Station SFC System		Waters	More information available at www.waters.com	Analytical SFC system
SFC-UV Prep 100		Waters	More information available at www.waters.com	Preparative SFC System
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004937	Analytical SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004945	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column		Waters	186004918	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column		Waters	186004944	Preparative SFC Chromatography Column