كشف اشارة المستجيب - مجمعات التكرير والتسويق لاستخدام BMP4 في الموقع جيش التحرير الشعبى الصينى ، وربط الفحص القرب

Summary

هنا نبين كيفية استخدام القرب ربط الفحص (PLA) ، مع مجموعة من الأجسام المضادة لبروتين العظام تصور التخلق (BMP) يشير في خلايا محددة. سمحت لنا هذه التقنية لمتابعة تراكم النووية الذاتية BMP - المستجيب تنشيط المجمعات وتحديد مستوياتها على مر الزمن تحت BMP4 التحفيز.

Abstract

أفضل الممارسات الإدارية هي المسؤولة عن طائفة واسعة من الآثار التنموية والبيولوجية. تنشيط مستقبلات BMP (phosphorylate) والمستجيبات Smad1/5/8 ، التي بعد ذلك ، شكل مجمع ونقل من مكان لآخر مع Smad4 إلى النواة حيث تعمل بوصفها عوامل النسخ لبدء الآثار BMP المصب محددة ^1. المناعية التقليدية مضان التقنيات مع أجسام مضادة ضد الفوسفات وصماد الببتيدات يحمل حساسية منخفضة ، وتقديم خلفية عالية الكمي الإجمالي لأنها تعتمد على كثافة إشارة الضد لا سيما إذا كان هذا هو حساس الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك ، قد الفوسفات وSmads لا تكون كلها في مجمع مع Smad4 وشارك في النسخ النشطة.

جيش التحرير الشعبى الصينى في الموقع هي تكنولوجيا قادرة على اكتشاف بروتين تفاعلات مع خصوصية عالية وحساسية ^2-4. هذه الأجسام المضادة الجديدة الأزواج الاعتراف التكنولوجيا مع التضخيم من الحمض النووي بديل للبروتين. فإنه يولد المترجمة ، إشارة منفصلة على شكل بقع الكشف عن الموضع الدقيق للحدث الاعتراف. ويمكن الاعتماد على عدد من الإشارات ومقارنتها توفير القياس. طبقنا في جيش التحرير الشعبى الصينى الموضع ، وذلك باستخدام عدة Duolink ، مع مجموعة من الأجسام المضادة التي تتيح الكشف عن المستجيبات يشير BMP phospho-Smad1/5/8 وSmad4 فقط عند هؤلاء في أي القرب في مجمع ، والذي يحدث فقط مع إشارات التنشيط. هذا يسمح للمرة الأولى ، تصور وقياس BMP الذاتية يشير مع خصوصية عالية وحساسية في زمن التجربة بالطبع تحت BMP4 التحفيز.

Protocol

1. طلي من الخلايا والمعاملة مع BMP

1. ثقافة الخلايا Neuro2a في GMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ ، 1X غير الأحماض الأمينية الأساسية (النعم) ، 1X البيروفات الصوديوم والجلوتامين L - 1X. انقسام الخلايا باستخدام التربسين (0.05 ٪ - EDTA) وصفيحة 15،000-20،000 الخلايا لكل بئر في شريحة 16 غرفة جيدا.
   
   ثقافة HEK293T أو خلايا Cos7 في DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ ، L - 1X الجلوتامين و1X البنسلين / الستبرتوميسين. تعقيم polysine الشرائح التي تخبط بها في الايثانول 70 ٪ واستخدام القلم Immedge التعادل 1 سم ² الآبار. انقسام الخلايا باستخدام التربسين (0.05 ٪ - EDTA) وصفيحة 20،000-25،000 الخلايا لكل بئر في 50 ميكرولتر المتوسطة.
2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب ، 5 ٪ CO ₂ الحاضنة.
3. بعد 24 ساعة استبدال المتوسطة مع المصل الحرة GMEM (تستكمل مع 0.1 ٪ الزلال ، 1X النعم ، 1X البيروفات الصوديوم والجلوتامين L - 1X) لNeuro2a أو مع DMEM مجانا المصل (تستكمل مع الجلوتامين L - 1X والبنسلين / الستبرتوميسين) لHEK293T / Cos7 واحتضان خلايا لحاء 2-3 تبقي ثلاث آبار مع الخلايا في ظل ظروف طبيعية زراعة (أي 10 ٪ FBS) لاستخدام والضوابط.
4. علاج الخلايا مع dorsomorphin (مثبط للمسار BMP ، 2 ميكرومتر) أو BMP4 (25 نانوغرام / مل) للمرة المطلوب (مثلا ح 10 دقيقة - 1) ^5.

2. التثبيت وPermeabilization

1. إعداد تثبيتي ، PFA 4 ٪. يزن 4 غراما من PFA لإعداد حل 4 ٪ في برنامج تلفزيوني 100 مل. الحل في الحارة 50 درجة مئوية حتى يصبح واضحا. مرشح الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. استخدام مثبت الطازجة (وليس تخزينها لأكثر من 2 أيام).
2. نضح المتوسط ​​من الآبار ، ويغسل مع 1xPBS. لا ماصة الحلول مباشرة على الخلايا لأن ذلك قد يؤدي إلى انفصال الخلايا. قبل الانتقال الى الخطوة التالية ، إذا كنت تستخدم شرائح غرفة إزالة الغرف ، ولكن ترك السيليكون حول الآبار.
3. إضافة 50 ميكرولتر PFA 4 ٪ ، واحتضان ل10min ، على RT ، من دون الانفعالات.
4. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لمدة 3 5 دقائق x في جرة Coplin مع التحريض على RT.
5. علاج الخلايا مع 0،5 ٪ تريتون X - 100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة دون التحريض على RT.
6. غسل الخلايا مع توين 0،05 ٪ في 20 TBS (TBS - T) لمدة 3 5 دقائق x في جرة Coplin مع التحريض على RT.

3. حظر

1. اضغط قبالة TBS - T. إضافة قطرة واحدة من الحلول Duolink الحظر الثاني (1X) لكل بئر.
2. احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.

4. الأجسام المضادة الأولية

1. خلط وتمييع aP-Smad1/5/8 (الأرنب النسائل المتعددة) في 1:100 ، وSmad4 (الماوس وحيدة النسيلة) في 1:100 في جسم Duolink مخفف الثاني (1X). أيضا بإعداد aP-Smad1/5/8 وحده ، Smad4 في تركيزات نفسه لاستخدامها في التحكم.
2. الحنفية الحل الحظر من الشرائح. إزالة أكبر قدر ممكن حل حجب ، ولكن اتخاذ مزيد من الحذر على عدم السماح للخلايا الجافة قبل إضافة الأضداد. إضافة 40 ميكرولتر الحلول الضد إلى الآبار. في واحدة فقط مخفف جيدا إضافة إلى السيطرة على جسم سلبية إضافية.

5. تحقيقات جيش التحرير الشعبى الصينى

1. تمييع تحقيقين جيش التحرير الشعبى الصينى (Duolink الثاني المضادة للماوس والطرح الثاني Duolink المضادة للأرنب PLUS) 1:05 في جسم مخفف.
2. الحنفية الحل الأساسي الضد من الشرائح. تغسل الشرائح 2 إلى 5 مرات كل دقيقة مع Duolink 1X الاحتياطي اغسل ثانيا ألف في جرة Coplin مع التحريض على RT.
3. الحنفية الاحتياطي غسل من الشرائح وإضافة حل جيش التحرير الشعبى الصينى التحقيق (40 ميكرولتر / جيد).
   احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.

6. رباط

1. دوامة وربط الثاني Duolink الأسهم (5X) ، وتمييع 01:05 في المياه عالية النقاء والمزيج. عند حساب حجم المياه ، وتأخذ بعين الاعتبار حجم يغاز التي ستضاف في التخفيف النهائية ل01:40 قبل إضافة الخليط إلى الآبار.
2. الحنفية الحل التحقيق جيش التحرير الشعبى الصينى من الشرائح. تغسل الشرائح في مخزن اغسل 1X A ل 2 إلى 5 مرات كل دقيقة في وعاء مع Coplin التحريض على RT.
3. إخراج يغاز من الفريزر باستخدام كتلة تجميد (-20 درجة مئوية). إضافة إلى الحل يغاز ربط (المعد في 6.1) في دوامة والتخفيف 01:40.
4. الحنفية الاحتياطي غسل من الشرائح وإضافة محلول الربط يغاز ، على كل جانب (40 ميكرولتر / جيد). احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

7. توسيع

ملاحظة : الكواشف الحساسة للضوء. الحفاظ على الشرائح محمية من الضوء.

1. تمييع التضخيم الثاني Duolink الأسهم (5X) 01:05 في المياه عالية النقاء والمزيج. عند حساب حجم المياه تأخذ في الاعتبار حجم البلمرة التي ستضاف في التخفيف النهائي من 1:80 قبل إضافة الخليط إلى عشره الآبار.
2. الحنفية الحل ربط - يغاز من الشرائح. تغسل الشرائح في مخزن اغسل 1X جواب مع 2 مرات عن 2 دقيقة في كل جرة Coplin مع التحريض على RT.
3. إخراج البلمرة من الفريزر باستخدام كتلة تجميد (-20 درجة مئوية). إضافة إلى الحل البلمرة التضخيم (المعد في 7.1) في تخفيف و1:80 الدوامة.
4. الحنفية الاحتياطي غسل من الشرائح وإضافة محلول البلمرة التضخيم ، إلى كل بئر (40 ميكرولتر / جيد). احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة قبل ساخنة لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

8. التحضير لتصوير

ملاحظة : الكواشف الحساسة للضوء. الحفاظ على الشرائح محمية من الضوء.

1. الحنفية الحل التضخيم ، البلمرة من الشرائح ويغسل لمدة 2 مرة الثانية في كل 10min 1X Duolink B الاحتياطي اغسل في جرة Coplin مع التحريض على RT.
2. تراجع الشرائح في 0.1 X باء الاحتياطي اغسل
3. إزالة السيليكون من الشريحة 16 - جيدا تماما. إضافة ~ 40μl الثانية في Duolink تركيب متوسطة مع دابي على ساترة ومكان برفق على عينات من الضغط عليه قليلا بحيث لا توجد فقاعات الهواء تحت الغطاء زلة. الإصلاح وختم ساترة على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر. انتظر على الأقل 15min قبل الشروع في التصوير.
4. تحليل العينات باستخدام المجهر مبائر أو مضان. الحصول على الصور الرقمية.

9. الكمي

ملاحظة : الكواشف الحساسة للضوء. الحفاظ على الشرائح محمية من الضوء.

1. استخدام Duolink ImageTool لحساب مؤشرات على الصور للحصول على قياس مستوى الإشارة.
2. مقارنة القياسات وجعل الرسم البياني.

10. ممثل النتائج

النتيجة من التجربة في جيش التحرير الشعبى الصينى الموضع يظهر بقع منفصلة كما الفلورسنت. موقع للإشارة يعتمد على بروتينات معينة دراستها.

الشكل 1. وفي الموضع على خلايا جيش التحرير الشعبى الصينى بعد Neuro2a BMP4 التحفيز. تم علاج الخلايا مع dorsomorphin ميكرومتر 2 (مثبط للمسار BMP) (A) أو 25 BMP4 نانوغرام / مل (B) لمدة 60 دقيقة أو تركت دون علاج (CE). استخدمت أجسام مضادة ضد P-Smad1/5/8 وSmad4 للكشف عن الأجسام المضادة النشطة في المجمعات وألف وباء وحدها aP-Smad1/5/8 الابتدائي (C) وحدها ، Smad4 (D) أو إغفال من جانب الأولية كانت تستخدم الأجسام المضادة (E) والضوابط. الزرقاء : دابي ؛ الأحمر : جيش التحرير الشعبى الصينى الإشارة. تم الحصول على الصور مع المجهر لايكا مبائر SP5.

(F) احصيت إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى مع برنامج ImageTool Duolink ويرد متوسط ​​عدد البقع في نواة كل خلية في الرسم البياني. (G) وترك الخلايا Neuro2a غير المعالجة أو المعالجة مع Dorsomorphin (2 ميكرون) أو BMP4 (25 نانوغرام / مل) لمدة 60 دقيقة. وlysed الخلايا والبروتينات تعرضوا لSDS - PAGE وتحليلها بواسطة immunoblotting مع aP-Smad1/5/8 وPCNA على النحو التحميل السيطرة. (*) غير محددة النطاق. لاحظ أن الأجسام المضادة aP-Smad1/5/8 لا يمكن التمييز بين مختلف البروتينات الموجودة في 3 معقدة مع Smad4.

Discussion

التصور المجمعات البروتين في الموقع هي في الطلب الكبير ، ولا سيما بالنسبة للدراسات في إشارة حيث التفاعل وتعديل البروتين البروتين هي الوسائل التي تستعملها الخلايا لارسال اشارة من سطحها إلى النواة. لم يكن من الممكن تصور وتحديد المجمعات بين اثنين من البروتينات الذاتية في الموقع مع المناعي من قبل. شارك في معارض توطين الأضداد القرار المنخفضة والتي لا يمكن استخدامها لتصور تفاعل حقيقي. جيش التحرير الشعبى الصينى هو الاسلوب الجديد الذي بدأت به الباحثون في نظم مختلفة مع النجاح الكبير ^{6 ، 7.} هنا ، ونحن لشرح كيفية استخدام جيش التحرير الشعبي الصيني ، ليس فقط لتصور ولكن أيضا لتحديد المجمعات المحلية بين المستجيبات صماد تنشيط المصب من التحفيز BMP مع مرور الوقت. استخدمنا خلايا الأنسجة المختلفة بما في ذلك Neuro2a وتعتمد على الأجسام المضادة التي أثيرت في الأنواع التجارية المختلفة (الماوس ، والأرانب Smad4 aP-Smad1/5/8) لتحقيق هذا (الشكل 1). هذا الأسلوب يسمح لنا ، لأول مرة ، لمعرفة تفعيل المجمعات المستجيب - BMP مع مرور الوقت وليس فقط وجود Smad1/5/8 فسفرته ، والتي قد لا تكون في جميع المجمعات نشطة مع Smad4. أحصينا الاشارات (التين 1F) ومقارنة مع قياس الكمي التي تم الحصول عليها من طخة مناعية من نفس الخلايا ⁸ (الشكل 1G). استنتجنا أن عدد البقع توفر دقة القياس المقارن للإشارات المستويات مع مرور الوقت. كما تم تطبيق هذه التقنية على خطوط الخلايا الأخرى (HEK293T وCos7) مع نتائج مماثلة (لا تظهر البيانات).

ويستند مبدأ التكنولوجيا على تحقيقين فريدة من نوعها تقدم مع عدة Duolink. كل مسبار جيش التحرير الشعبى الصينى يتكون من الأجسام المضادة الثانوية الملحقة قليل النوكليوتيد الاصطناعية فريدة من نوعها ، التي تعمل كمراسلة. على مقربة من التحقيقات يسمح ربط الحمض النووي في المكان المحدد حيث تعلق هذه التحقيقات في القرب. المسافة من [أليغنوكليوتيد] ، والذي يسمح التهجين الحمض النووي وربط صغيرة (<40nm) ، وبالتالي ، لا يمكن إلا أن تتفاعل البروتينات تتيح ربط. ويمكن بعد ذلك أن الحمض النووي ligated تضخيمها والكشف عن تهجين مع المسمى [أليغنوكليوتيد] تسلسل تضخيمها. والتضخيم غير محددة لأنها تعتمد على مبادئ تهجين الحمض النووي DNA ، ويوفر أيضا حساسية عالية كما هو تضخيم الحمض النووي ligated عدة أضعاف مما أدى إلى تعزيز ربط الحدث الأولي. يتم الكشف عن الحمض النووي التي تضخمت التهجين مع [أليغنوكليوتيد] وصفت وتنتج بقعة واضحة وكبيرة نوعا ما. كما يمكن أن تحسب النقاط ، إشارة جيش التحرير الشعبى الصينى يوفر ليس فقط على المعلومات المكانية الدقيقة (موقع أحداث التفاعل) ، ولكن أيضا وسيلة قياس الهدف من هذه الأحداث ^2-4.

غيرها من التقنيات التي تستخدم للكشف عن البروتين التفاعلات منها العيش المشترك ، مناعي ، immunofluoresence ونيون نقل الطاقة الرنين (الحنق). وتستخدم على نطاق واسع شارك في مناعي المقايسات تمكين عزل بروتين المجمعات. ويرافق الطريقة التي immunoblotting مما يعني أنه يجب أن يتم التعبير عن البروتينات عند مستويات مرتفعة نسبيا ليتم الكشف. مشاكل خلفية عالية أو غير محددة وملزمة لبعض البروتينات لحبات في بعض الأحيان من الصعب التغلب عليها في مناعي المشترك. بالإضافة إلى ذلك ، شارك في مناعي المقايسات السماح للكشف عن البروتينات التي يمكن أن تكون جزءا من بروتين معقد ولكن لا يمكن التمييز بين تلك التي هي على مقربة جدا جسديا التفاعل مع بعضها البعض. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تشارك في immunoprecipitations لا توفر الكميات في قرار خلية واحدة أو معلومات عن توطين المجمعات البروتين في الخلية. ويستند الكشف التعايش مجمعات البروتين في الخلية أو حجرة خلية immunofluoresence على التداخل في إشارات تنتشر وبالتالي ، فإن القرار المكانية منخفضة ، ولا يمكن توفير معلومات دقيقة عن التفاعلات البروتينية. ويمكن أن يتم التحديد الكمي للإشارة immunofluoresence البصرية عن طريق تقدير إلا إذا كان الفرق هو أضعاف عدة ، ويمكن أن لا تكون دقيقة أو قابلة للقياس مثل البقع جيش التحرير الشعبى الصينى. الحنق يسمح التصور من المجمعات البروتين في الخلايا الحية ويتغلب على الحاجة إلى الأضداد ، وتعرض للحاتمة. لكن الحنق يعتمد عادة على overexpression من البروتينات تنصهر الاصطناعية ، والتي قد لا تعكس مجمعات البروتين الذاتية كما في جيش التحرير الشعبى الصينى.

شروط حظر في بروتوكول جيش التحرير الشعبى الصينى حاسمة بأنها تجميع الأجسام المضادة وزيادة قد تحدث في الخلفية. ويمكن الاطلاع على شروط بديلة تسد في ورقة المنتج الأضداد. ضوابط ملائمة مع إغفال الضد الابتدائية والثانوية تقديم معلومات بشأن ما قد حصل من خطأ وأنها بحاجة إلى أن تدرج دائما. من المهم أن الشاشة الأضداد المختلفة التي من شأنها أن تعطي خلفية الأقل عندما تستخدم وحدها ، وأفضل إشارة عندما يكونان معا. التثبيت من سلأمر بالغ الأهمية ليرة سورية مع الافراط في تحديد المجمعات قد يسبب البروتين لتفسد تماما وتتحلل ، في حين أن التثبيت غير كاف قد يؤدي إلى فقدان البروتين المجمعات خلال خطوات الإجراء. يمكن التحكم بذلك عن طريق تخفيض تركيز تثبيتي إلى 3 ٪ أو عن طريق الحد من الوقت التثبيت. ومع ذلك ، فإن تثبيت يعتمد أيضا على ما إذا كانت الأجسام المضادة الأولية الاعتراف البروتينات المعطل أم لا. وهذا الاسلوب هو جيش التحرير الشعبى الصينى حساسة للغاية ، وهناك حاجة إلى رعاية خاصة للحفاظ على حضانة الأوقات والظروف الدقيقة المساواة بين عينات مختلفة.

لا ينبغي أن تكون العينات تترك لتجف في أي حال قبل الخطوة النهائية. يمكن تجفيف العينات يؤدي إلى زيادة الخلفية. الإزالة الكاملة للعرقلة الحل أمر بالغ الأهمية أيضا من أجل تجنب الخلفية. يجب دائما غسل المخازن أن يقدموا إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام ، ودرجة حرارة منخفضة يبطئ التفاعلات الأنزيمية. لاستكشاف مزيد من الرجوع إلى دليل لكيت.

ومن المفيد استخدام بقع للتأكد من الترجمة شبه الخلوية للإشارة جيش التحرير الشعبى الصينى (مثل دابي ، أكتين الخ). هنا استخدمنا دابي (في المتوسط ​​التركيب) لصمة النوى. جيش التحرير الشعبى الصينى متوافق مع استخدام المناعي مع أجسام مضادة لتحديد نوع الخلية أو مقصورة الخلوية (لا يظهر هنا). ويمكن أن يتم تقدير دقيق عن طريق عد الإشارات ، واستخدام برامج معينة (Duolink أداة الصور ، Olink Biosience).

في الختام لقد أثبتنا في كيفية استخدام الموقع جيش التحرير الشعبى الصينى ، وذلك باستخدام عدة للكشف عن Duolink BMP يشير في الخلايا الثابتة وقدم مزاياه : سهل الاستخدام ، وحساسة للغاية ، الخلفية لا ، وقدرة فريدة لتحديد BMP نشط يشير في الموقع.

الحد من تطبيق هذه التقنية لدراسة التفاعلات بين البروتينات المختلفة يعتمد على مدى توافر ونوعية الأجسام المضادة الأولية التي تعترف البروتينات قيد التحقيق.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GMEM	Invitrogen	21710025
DMEM	Invitrogen	21063029
FBS	AutogenBioclear	7.01
Non-essential Amino Acids	Invitrogen	11149068
Sodium Pyruvate	Invitrogen	11360070
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140122
L-glutamine	Invitrogen	25030-054
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid	Invitrogen	25300-054
16-well chamber slides	Lab-Tek	178599
Polysine	VWR international	631-0107
Cover glass	VWR international	631-0138
a-pSmad1/5/8	Cell Signaling Technology	9511
a-Smad4 (B8)	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-7966
Dorsomorphin	Merck & Co., Inc.	171260-10MG
Recombinant Mouse BMP-4	R&D Systems	5020-BP-010
PFA	Sigma-Aldrich	P6148
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Promega Corp.	H5151
Duolink II Detection Reagents (Orange)	Olink Bioscience	92007-0100
Duolink II PLA probe anti-Mouse MINUS	Olink Bioscience	92004-0100
Duolink II PLA probe anti-Rabbit PLUS	Olink Bioscience	92002-0100
Duolink II Mounting Medium with DAPI	Olink Bioscience	82040-0005
Duolink II Wash Buffers Fluorescence	Olink Bioscience	82049