حقن الانسولين واستخراج الدملمف لقياس حساسية الانسولين في الكبار ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em

Summary

العثور على مسارات الحفظ إشارات الانسولين في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء البطن جعل هذا الكائن أداة محتملة للنمذجة الاضطرابات الأيضية بما فيها النوع الثاني من السكري. تحقيقا لهذه الغاية ، من المهم جدا لإنشاء المقايسات الفسيولوجية لقياس فعالية المنهجية عمل الانسولين في التخلص من الغلوكوز في محيطي يطير الكبار.

Abstract

حفظ المواد الغذائية آليات الاستشعار الموجودة بين الثدييات وذبابة الفاكهة التي تشبه الببتيدات الانسولين والجلوكاجون الثدييات ، على التوالي وظيفة للحفاظ على توازن السكر في خلال مراحل النمو ^1،2 اليرقات. وقد كشفت الدراسات عن الذباب الكبار إلى حد كبير بعد الإنقسامية من اضطراب توازن الجلوكوز نتيجة الاجتثاث الوراثية للأنسولين مثل الببتيد (ILP) الخلايا المنتجة (IPCS) ^3. وهكذا ، ذباب الفاكهة الكبار على وعود كبيرة كنظام نموذج مناسب لالوراثية الاضطرابات الأيضية بما فيها النوع الثاني من السكري. لمزيد من تطوير نظام ذبابة الفاكهة ، يجب وضع المقايسات الفسيولوجية للمقارنة المستخدمة لقياس تحمل الغلوكوز والحساسية للانسولين في الثدييات. لهذا الغرض ، وقد وصفت لنا في الآونة الأخيرة إجراء الرواية الشفوية لقياس استجابة التسامح الجلوكوز في الطيران الكبار وأظهرت أهمية IPCS الكبار في الحفاظ على توازن السكر في ^4،5. هنا ، قد عدلت أننا إجراء سبق وصفها للحقن الانسولين ⁽⁶⁾ ودمجتها مع طريقة استخراج الدملمف رواية لقياس حساسية الإنسولين الطرفية في الطيران الكبار. فريد ، لدينا بروتوكول يسمح القياسات الفسيولوجية المباشر على قدرة الطيران الكبار للتخلص من حمولة الجلوكوز الطرفية عند حقن الانسولين ، والمنهجية التي تجعل من الممكن لتوصيف المسوخ الانسولين مما يشير والتدخلات المحتملة التي تؤثر على تحمل الغلوكوز وحساسية الانسولين في الطيران الكبار.

Protocol

1. الحل تحضير الأنسولين

1. تحضير الأنسولين البقري الطازج حل عن طريق إذابة الانسولين في برنامج تلفزيوني لتحقيق تركيز 0.01 ملغ / مل. يجب أن يبقى كل من الأنسولين / برنامج تلفزيوني وحلول التحكم في برنامج تلفزيوني على الجليد طوال إجراءات الحقن. وينبغي إعداد هذه الحلول مع 0.5 ٪ (V / V) FD & C لم الأزرق. 1 الغذاء التلوين.

2. تحضير وحقن ابرة تعيين المتابعة

1. تعد الإبر الزجاج الشعرية باستخدام الإعدادات التالية puller.The micropipette مجتذب إنتاج الإبر ذات نوعية كافية للحقن : الحرارة ، 345 ؛ السحب ، 210 ؛ السرعة ، 100 ؛ من الزمن ، 200 (100ms). يجب اضعافها الإبر سحبت حديثا عن طريق الضغط على طرف من خلال نسيج Kimwipe. هذه العملية يزيل تصد ممدود غيض مقاومة عالية وتنتج تلميح stouter بقطر أكبر المسام.
2. مكان الإبر اضعافها غيض المتابعة في أنبوب يحتوي على الأنسولين microcentrifuge / PBS حل أو برنامج تلفزيوني وحدها. عمل شعري النتائج في ملء الظهير كل إبرة. احتفال رأس الإبرة تحت stereomicroscope لضمان عدم وجود فقاعات الهواء أو الحطام تظهر على الحافة. تجاهل أي الإبر التي لا تملأ نظيفة.
3. ادخال الإبر في شغل الإبرة حامل دليل microinjector وموقف حامل الإبرة مع micromanipulator بحيث طرف الإبرة مرئيا من خلال stereomicroscope. تطبيق الضغط الايجابي على عمود السائل في الإبرة التي تحول ميكرومتر microinjector مقبض يدوي تعلق على الغواص على حقنة microinjector.
4. وقد تم تطبيق تحقق ما يكفي من الضغط لنزوح السوائل عن طريق لمس Kimwipe إلى رأس الإبرة وتؤكد تدفق السوائل.
5. مرة واحدة وقد تم إعداد إبرة للحقن ، لصق مخطط المعايرة على جذع إبرة مع الشريط واضحة ، وجلب رأس الإبرة من خلال التركيز stereomicroscope 20X تحت التكبير.

3. يطير التحضير

1. وتستخدم لمدة عشرة أيام عمره الذباب الإناث للتجارب الحقن. جمع الذباب في غضون 24 ساعة من eclosion. تخدير الذباب مع CO ₂ مرطب على وسادة الغاز ، ويفرز الذكور والإناث في مكان الذباب قارورة تحتوي على معيار أو نظام غذائي العلاج. الحفاظ على وجبات الذباب الإناث تجريبية لمدة 10 يوما.
2. في اليوم العاشر الموالي eclosion والانفصال إلى الوجبات التجريبية ، ونقل الذباب من المواد الغذائية التي تحتوي على قوارير على قارورة تحتوي على المكونات 5 مل من 2 ٪ ، وأغار عليها لتجويع 12-16 ساعة.
3. نقل الذباب جوعا على قارورة تحتوي على مرشحات الجلوكوز 10 ٪ ينقع لمدة 1 ساعة قبل حقن الانسولين.
4. تخدير لفترة وجيزة مع الذباب CO ₂ مرطب بعد الرضاعة الجلوكوز ويستوقف ثم الباردة لهم على الجليد.

4. الحقن الداخلي

1. فهم بلطف ذبابة يجمد الباردة مع زوج من ملقط الغرامة والاحتفاظ بها على مقربة من الحافة الإبرة بحيث غيض المتاخمة للمنطقة الأمامية من الجانب الأيسر من الصدر الذبابة. جعل كل طرف الإبرة والصدر الذبابة في التركيز في إطار stereomicroscope.
2. تحرك بلطف يطير باتجاه رأس الإبرة بحيث يلامس طرف إبرة وسط الناشزة في المنطقة اليسرى من الصدر prescutum الذبابة (الشكل 1). مرة واحدة موجه بشكل صحيح ويطير الانحياز مع طرف الإبرة ، ومواصلة التقدم في الطيران على الإبرة بحيث يخوزق إبرة وسط prescutum.
3. تطبيق الضغط الايجابي حسب الحاجة من خلال دفع المكبس المحاقن مع مقبض micromanipulator في microinjector حتى تم ضخ 0.1 ميكرولتر من السوائل في الطيران. وتدفق السائل في hemocoel الذبابة إضفاء اللون الأزرق على الجانب الأيسر من الصدر الأمامي. أحيانا لا بد من التراجع والتقدم عدة مرات لإزاحة أي انسداد طرف إبرة والسماح لتدفق السوائل.
4. السماح لاسترداد الذباب حقن في قارورة آغار 2 ٪ للحصول على نقاط قبل الوقت المحدد استخراج الدملمف.

5. الدملمف كوكتيل

1. تخدير لفترة وجيزة مع الذباب ثاني مرطب ₂ في الوقت المطلوب نقاط بعد الحقن ، وموقف كل جانب الظهرية يطير لأسفل على وجهين الشريط الملصقة على سطح اللوحة ₂ CO. ترتيب الذباب في الصفوف حتى مع كبسولات رئيس الانحياز. يمكن للمرء استخدام عصا خشبية لقضيب قلص الصحافة اجنحتها في شريط لاصق ، وضمان عدم الحركة.
2. مرة واحدة يتم إصلاح الذباب على الشريط ، واغتنام كل ذبابة خرطوم ملقط مع الغرامة وسحب برفق تجاه المنطقة البطنية ثم الخلفي للتحرك بحيث الجزء الأمامي من الرأس كبسولة وضوحا من خلال مجهر ستيريو.
3. بيدك الأخرى ، وحين يمسك خرطوم في الموقف ، وثقب في وسط رأسه كبسولة فقط فوق الدرز ptilinal باستخدام إبرة حادة التنغستن (الشكل 2). يجب على المرء أن يكون حريصا على عدم ادخال الإبرة بعيدا جدا لأنه من السهل لكمة غيض من الإبرة من خلال الجانب الآخر من كبسولة الرأس وتفقد في وقت لاحق جontrol تدفق الدملمف. ثقب الذباب كل ذلك في مجموعة الحقن قبل جمع الدملمف.
4. بمجرد ثقب كبسولة الرأس ، واستخدام عصا خشبية قلص قضيب لتطبيق الضغط بلطف على بطن الذبابة. قد يكون من المفيد للفة تطير فوق ذلك أنه يعتمد على الجانب البطني وتطبيق الضغط. وسوف ينتج هذا الإجراء بقطرة من الدملمف من ثقب كبسولة موقع الرأس.
5. لمسة واحدة من نهاية أنبوب microcapillary 1μl إلى قطرة الدملمف الناشئة من موقع رئيس ثقب كبسولة. سوف الدملمف أدخل أنبوب عبر العمل الشعري. تحديد وتسجيل كمية الدملمف جمعها عن طريق التحقق من عمود السائل داخل الأنبوب microcapillary ضد مخطط حجم تخرج.

6. الدملمف الجلوكوز تقدير

1. إخراج عينات الدملمف microplate في الآبار التي تحتوي على 100 ميكرولتر من الجلوكوز الكاشف إنفينيتي. إبقاء لوحة على الجليد أثناء تحميل عينات الدملمف.
2. إنشاء منحنى القياسية عن طريق تحميل كل على حدة 1 ميكرولتر من الحلول الأسهم الجلوكوز في 50mM ، 25mM ، 6.25mM ، و12.5mM 3.125mM.
3. احتضان عينات في 37 دقيقة لمدة 10 درجة مئوية.
4. كشف الامتصاصية في 340 نانومتر.
5. لحساب حجم الدملمف جمع العينات وتحديد تركيز الغلوكوز استنادا إلى منحنى القياسية مع تركيز الجلوكوز معروفة.

7. ممثل النتائج

تم الكشف عن التسامح الانسولين استجابة نموذجية في الذباب ، حقن الانسولين حيث تم الكشف عن انخفاض مستويات السكر في تعميم 15 دقيقة بعد الحقن. في المقابل ، لا ينظر إلى مثل هذه الاستجابة في الذباب PBS حقن (الشكل 3). هذا الرد في التخلص من الغلوكوز المحيطي يستمر في حقن الانسولين الذباب ، يصل إلى 30 دقيقة بعد الحقن. نخرج بصورة روتينية 0،2-0،5 ميكرولتر من الدملمف 4-5 في الذباب في كل مجموعة الحقن. وشملت مجموعات ضخ ثلاثة في كل تجربة.

الشكل 1. الجانب الأيسر من الصدر ذبابة الفاكهة تظهر الإبرة موقع الإدراج (تم التعديل من Demerec ، 1950) ^7. أدخل الإبرة من خلال مركز prescutum على المنطقة ، الظهرية الأمامية من الجانب الأيسر من الصدر.

الشكل 2. عرض أمامي لرأس ذبابة الفاكهة تبين موقع البزل لاستخراج الدملمف (معدلة من Demerec ، 1950) ^7. ثقب كبسولة الرأس مع التحقيق الذي تجريه التنغستن شحذ ناعما في وسط الكبسولة الرأس فقط فوق الدرز ptilinal.

الشكل 3. التسامح والانسولين استجابة نموذجية في الكشف عن سيطرة الكبار الذباب. تم حقن السيطرة الذباب ث ¹¹¹⁸ مع الانسولين البقري (1 نانوغرام في برنامج تلفزيوني) ، أو برنامج تلفزيوني فقط. ثم سمح الذباب في مجموعات لاسترداد نسخ دقائق 0 ، 15 أو 30 ومستويات السكر في تعميم تم قياسه.

Discussion

تقنية وصفها في هذا التقرير قد تكون مفيدة في أي دراسة العمليات الفيزيولوجية التي تحقق مما أدى إلى اكتشاف تغيرات في تركيبة الدملمف ذبابة الفاكهة. من خلال الجمع بين الحقن وجمع الدملمف بهذه الطريقة ، فمن الممكن للتأكد من الآثار المباشرة ذات الصلة من الناحية الفسيول...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف / المعدات	شركة	فهرس العدد
الأنسولين البقري	سيغما	I5500
اللانهاية الجلوكوز الكاشف	شركة الكترون الحرارية	TR1541
دليل microinjector	سوتر الصك
P - 87 Flamming / براون micropipette مجتذب	سوتر الصك
برميل واحد من الزجاج البورسليكات الشعرية	نظم AM	626000
FD & C الأزرق رقم (1)	ماكورميك آند كومباني
1 أنابيب microcapillary ميكرولتر	دروموند
ثلاثة محاور micromanipulator اليدوية والقاعدة	العالم آلات دقيقة