İnsülin Enjeksiyon ve Yetişkin İnsülin Hassasiyet Tedbir hemolimf Ekstraksiyon Drosophila melanogaster</em

Özet

Korunmuş insülin sinyalizasyonu meyve sineği bulundu yolaklar Drosophila melanogaster Bu organizmanın, tip II diyabet gibi metabolik bozukluklar modelleme için potansiyel bir araç yapmak. Bu amaçla, erişkin sinek periferik glukoz bertaraf edilmesinde etkili sistemik insülin etkisini ölçmek için fizyolojik testleri kurmak için kritik öneme sahiptir.

Özet

Korunmuş besin algılama mekanizmaları, memeli ve peptidler gelişimsel larva ^aşamaları 1,2 sırasında glikoz dengesini korumak için sırasıyla memeli insülin ve glukagon, fonksiyon benzeyen meyve sineği arasındaki mevcut . Büyük ölçüde post-mitotik yetişkin sinekleri üzerinde yapılan çalışmalar, insülin-benzeri hücreler ^(IPC) 3 üreten peptid (ILP) genetik ablasyonu sonucu glikoz dengesini pertürbasyon ortaya koymuştur. Böylece, yetişkin meyve sinekleri, tip II diyabet gibi metabolik bozukluklar için uygun bir genetik model sistem olarak büyük umut tutun. Meyve sineği sistemi daha da geliştirmek için, memelilerde glukoz toleransı ve insülin duyarlılığını ölçmek için kullanılan karşılaştırılabilir fizyolojik testlerin oluşturulması gerekir. Bu amaçla, son zamanlarda erişkin sinek oral glukoz tolerans tepki ölçmek için bir roman prosedürü tarif var ve glikoz dengesini ^4,5 korunmasında yetişkin IPCs önemini göstermiştir. Burada insülin enjeksiyonu ⁶ için daha önce açıklanan prosedür değiştirilmiş ve erişkin sinek periferik insülin duyarlılığını ölçmek için yeni bir hemolimf ekstraksiyon yöntemi ile kombine var. Benzersiz, protokol erişkin sinek insülin enjeksiyonu, insülin sinyal mutantlar ve erişkin sinek glukoz toleransı ve insülin duyarlılığını etkileyen olası müdahaleler karakterize etmek mümkün kılan bir metodoloji üzerine periferik glukoz yükü elden çıkarma yeteneği doğrudan fizyolojik ölçümler sağlar.

Protokol

1. İnsülin Çözüm Hazırlığı

1. 0.01 mg / ml konsantrasyonu elde etmek için PBS içinde insülin eriterek taze sığır insülin çözüm hazırlayın. Insülin / PBS ve kontrol PBS iki çözüm de enjeksiyon prosedürü boyunca buz üzerinde tutulmalıdır. Bu çözümler,% 0.5 (v / v) FD & C mavi no ile hazırlanmalıdır. 1 gıda renklendirme.

2. İğne hazırlanması ve Enjeksiyon Set-up

1. Kapiller cam iğneler, çekin, 210; Hız, 100; Zaman, 200 (100ms) Isı, 345: çektirmenin ayarları enjeksiyon için yeterli kalitede iğne üreten aşağıdaki mikropipet puller.The kullanarak hazırlayın. Taze çekilmiş iğne ucu Kimwipe doku üzerinden basarak köreldiğini olmalıdır. Bu küntleşme süreci uzamış yüksek direnç ucu kaldırır ve daha büyük bir gözenek çapı ile stouter ucu üretir.
2. Köreldiğini iğne ucu-insülin / yalnız PBS solüsyonu veya PBS içeren bir mikrosantrifüj tüp yerleştirin. Her iğne geri-dolum eylem sonuç Kılcal. Stereomicroscope altında hiçbir enkaz veya hava kabarcıkları ucunda görüntülendiğinden emin olmak için bir iğne ucu uyun. Temiz doldurmak değil herhangi bir iğne atın.
3. Iğne ucu bir stereomikroskopta görünür böylece manuel mikroenjektör iğne tutucu ve pozisyon iğne tutucu bir micromanipulator ile doldurulur iğne takın. Mikroenjektör şırınga üzerindeki pimi takılı el mikroenjektör mikrometre düğmesini çevirerek iğne sıvı sütun üzerinde pozitif basınç uygulayın.
4. Iğne ucu Kimwipe dokunmadan ve sıvı akışını doğrulayan doğrulayın sıvının yer değiştirmesi için yeterli basınç tatbik edilmiştir.
5. İğnenin açık bant yapıştırmayın iğne mili, enjeksiyon için bir kalibrasyon grafiği hazırlanır ve 20X büyütme altında, bir stereomikroskopta iğne ucu ile odak noktası haline getirmek olmuştur.

3. Hazırlık Fly

1. On günlük erkek sineklerin enjeksiyon deneyleri için kullanılmaktadır. Eclosion 24 saat içinde sinekleri toplayın. Erkek yeri ve erkek sineklerin dışarı standart veya tedavisinde diyet içeren flakon içine bir gaz ped nemlendirilmiş CO _2, sıralama sinekler anestezisi. 10 gün boyunca deneysel diyetler erkek sineklerin koruyun.
2. Deneysel diyetler eclosion ve ayırma takip eden onuncu gün, transfer, 5 ml% 2 agar fişi içeren şişeleri, gıda içeren flakon uçar ve 12-16 saat açlıktan
3. 1 saat süreyle insülin enjeksiyon öncesinde% 10 glukoz batırılmış filtreleri içeren flakon açlıktan sinek aktarın.
4. Kısaca glikoz beslenmeden sonra nemlendirilmiş CO ₂ sinekler uyutmak ve o zaman soğuk, buz onları hareketsiz.

4. Enjeksiyon Yöntemi

1. Yavaşça ince forseps bir çift ile bir soğuk immobilize sinek kavramak ve ucu sinek toraks sol tarafında ön bölgeye bitişik şekilde iğne ucu yakın tutun. Stereomicroscope altında iğne ucu ve sinek toraks hem de odak noktası haline getirin.
2. Iğne ucu tümsek sinek toraks (Şekil 1) sol prescutum bölgenin merkezi değecek şekilde hafifçe sinek iğne ucu doğru hareket ettirin. Sinek düzgün odaklı ve iğne ucu ile uyumlu bir kez, böylece iğne iğne prescutum merkezinde impales üzerine sinek ilerlemeye devam ediyor.
3. Sıvı 0.1 ul sinek içine enjekte edilmiş kadar mikroenjektör mikromanipülatör düğmesi ile şırınga pistonu ilerleyen gerektiği gibi pozitif basınç uygulayın. Sinek hemocoel içine sıvı akışı, ön Toraks sol tarafına mavi bir renk verir. Bazen bir geri çekin ve herhangi bir iğne ucu tıkanması yerinden ve sıvı akışı için izin vermek için birkaç kez ilerlemek gerekir.
4. Enjekte sinekler hemolimf çıkarma önce belirlenmiş zaman noktaları için% 2 agar şişeleri kurtarmak için izin verin.

5. Hemolimf Koleksiyon

1. Kısaca istenilen enjeksiyon sonrası zaman noktalarında ve pozisyon nemlendirilmiş CO ₂ sinekler uyutmak dorsal tarafı aşağı bir CO ₂ pad yüzeyine yapıştırılmış çift taraflı bant her sinek. Hizalı kafa kapsül ile satır bile sinek düzenleyin. Bir yapıştırıcı bant kanatları basın ve immobilizasyon sağlamak için kesilmiş ahşap bir aplikatör çubuk kullanabilirsiniz.
2. Sinek, bant sabit, ince forseps ile her sineğin burnumun kavramak ve baş kapsül ön stereo mikroskop ile görülebilecek şekilde, hafifçe sinek, karın ve arka sonra bölgeye yönelik çekin.
3. Diğer el ile ve burnumun pozisyonda tutarak, delinme ptilinal sütür sadece üzerinde kafa kapsül merkezi keskin bir tungsten iğne kullanılarak (Şekil 2). Baş kapsülü diğer tarafı ile iğne ucu yumruk ve daha sonra c kaybetmek kolaydır Bir çok uzak iğne eklemek için dikkatli olmak gerekirhemolimf akış ontrol. Delinme hemolimf toplama önce bir enjeksiyon grubunda uçar.
4. Baş kapsülü delinmiş edildikten sonra, hafifçe sinek karına baskı uygulamak için kesilmiş ahşap bir aplikatör çubuk kullanabilirsiniz. Bu kadar üzerinde baskı uygulamak gibi ventral tarafta aittir sinek rulo için yararlı olabilir. Bu prosedür, baş kapsül ponksiyon sitesinden hemolimf Bir damla üretecek.
5. Baş kapsül ponksiyon sitesinde çıkan hemolimf damlacık 1μl microcapillary bir tüp bir ucundan dokunun. Hemolimf kapiller eylem ile tüp girecektir. Mezun bir miktar çizelgesi karşı microcapillary tüp içinde sıvı sütununu kontrol ederek toplanan hemolimf miktarını belirleyin ve kaydedin.

6. Hemolimf Glikoz Belirlenmesi

1. Mikroplaka kuyuları Infinity Glikoz Reaktif 100 ul içeren hemolimf örnekleri çıkarın. Hemolimf örnekleri yüklenirken buz üzerinde plaka tutun.
2. 50mm, 25mm, 12.5mm, 6.25mM ve 3.125mM 1 ul şekeri stok çözümlerin her biri ayrı ayrı yükleyerek bir standart eğri oluşturulması.
3. 37 numune ° C'de 10 dakika.
4. 340 nm'de absorbans algılar.
5. Hesap hemolimf hacmi için toplanan ve bilinen glikoz konsantrasyonları ile standart eğri dayalı örnek glukoz konsantrasyonu belirlemek.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Tipik bir insülin tolerans yanıt glikoz düzeylerinin bir damla enjeksiyon sonrası 15 dakika tespit ve insülin enjekte sinekler tespit edilmiştir. Buna karşılık, bu tür tepki PBS enjekte sinekler (Şekil 3) görülmez. Periferik glukoz bertaraf Bu yanıt insülin enjekte devam enjeksiyon sonrası 30 dakika kadar uçar. Biz, her enjeksiyon grubunda rutin olarak 4-5 sinek başına 0.2-0.5 ul hemolimf ayıklayın. Üç enjeksiyon grubu, her bir deney yer almaktadır.

Şekil 1 Drosophila toraks iğne ekleme sitesi (Demerec, 1950 Değiştirilmiş) ⁷ gösteren sol tarafında. Prescutum, göğüs kafesinin sol tarafında ön, dorsal bölge merkezi aracılığıyla iğne yerleştirin.

Şekil 2 hemolimf çıkarımı (Demerec, 1950 Değiştirilmiş) ⁷ ponksiyon yerini gösteren Drosophila kafa Önden görünüm. Delinme ptilinal sütür sadece üzerinde kafa kapsül merkezinde ince bilenmiş tungsten probu ile baş kapsül.

Şekil 3 kontrolü yetişkin tespit tipik bir insülin tolerans yanıt uçar. Kontrol w ¹¹¹⁸ sinekler, sığır insülini (PBS içinde 1 ng) veya PBS sadece enjekte edildi . 0, 15 veya 30 dakika ve glikoz düzeyleri dolaşan kurtarmak için çoğaltmak gruplar halinde Sinekler sonra izin verildi ölçüldü.

Tartışmalar

Bu raporda açıklanan teknik Drosophila hemolimf kompozisyon saptanabilir değişiklikler sonucu fizyolojik süreçleri araştıran bir çalışmada, potansiyel olarak yararlı olur. Bu şekilde enjeksiyon ve hemolimf toplama birleştirerek, belirli bir deneysel tedavi veya manipülasyon anında önemli fizyolojik etkilerini tespit etmek mümkündür. Dekapitasyon ² içeren önceki teknikleri üzerine hemolimf koleksiyonunda bu "katliam" tekniğinin en önemli avantajı, bağırsak content...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / ekipman Adı	Şirket	Katalog numarası
Sığır insülin	Sigma	I5500
Infinity Glikoz Reaktif	Thermo Electron Corporation	TR1541
Manuel mikroenjektör	Sutter Enstrüman
P-87 Flamming / Brown mikropipet çektirmesi	Sutter Enstrüman
Tek varil borosilikat kılcal cam	AM Sistemleri	626000
FD & C Blue No: 1	McCormick & Company
1 ul microcapillary tüpler	Drummond
Üç eksenli manuel mikromanipülatör ve baz	Dünya Hassas Aletler