قياس التردد من ورم الخلايا باستخدام الحد من نشر زرع الخلايا في التخفيف اسماك الزرد مسانج

Summary

وتستخدم الحد المقايسات زرع الخلايا لتحديد تخفيف وتيرة نشر خلايا الورم. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد الزرد مسانج أن fluorescently بسرطان الدم المسمى وتفاصيل كيفية عزل وزرع هذه الخلايا في الحد من سرطان الدم التخفيف في التجويف البريتوني من الزرد الكبار.

Abstract

الخلايا السرطانية الذاتي تجديد هي أنواع الخلايا السرطانية فقط في غضون التي لديها قدرة غير محدودة لتشجيع نمو الورم ، وبالتالي فهي معروفة للورم خلايا التكاثر ، أو خلايا الورم البدء. ويعتقد أن استهداف هذه الخلايا ذاتية تجديد لتدمير ستمنع تطور الورم ومنع الانتكاس ، وتحسين تشخيص المريض كثيرا ^1. الطريقة الأكثر شيوعا لتحديد وتيرة الذاتي تجديد خلايا الورم داخل خلية تخفيف الحد مقايسة لزراعة الأعضاء ، حيث يتم زرع الخلايا السرطانية في الحيوانات المتلقي بجرعات متزايدة ، وتستخدم نسبة من الحيوانات التي تطور الأورام وحساب عدد في تقرير المصير ، تجديد الخلايا السرطانية داخل العينة الأصلي ^{2 ، 3.} من الناحية المثالية ، سوف تستخدم عددا كبيرا من الحيوانات في كل تجربة تخفيف تحد لتحديد بدقة وتيرة نشر خلايا الورم. ومع ذلك ، وتجارب واسعة النطاق تشمل الفئران هي مكلفة ، ومعظم المقايسات تخفيف الحد من استخدام الفئران فقط 10-15 في التجربة.

وقد اكتسبت شهرة الزرد كنموذج السرطان ، في جزء كبير نظرا لسهولة التلاعب بها الوراثية والاقتصاد التي يمكن أن يؤديها تجارب واسعة النطاق. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على أكثر أنواع السرطان على غرار لتقليد في الزرد عن كثب على نظيره ⁴ الأمراض التي تصيب البشر. في حين أنه من الممكن زراعة خلايا الورم من الأسماك إلى آخر عن طريق شبه قاتلة تشعيع الحيوانات المتلقية ، وتجديد النظام المناعي بعد 21 يوما وغالبا ما يسبب انحسار الورم ^5. وقد سهلت إنشاء مؤخرا الزرد مسانج الدراسات زرع ورم كبير ^6-8. يمكن رصدها لهذه الحيوانات ، زرع خلايا متطابقة جينيا تدبر الورم بقوة في الأسماك المستفيدة ، ونمو الورم على مدى فترات طويلة من الزمن. مسانج الزرد مثالية للحد من المقايسات زرع التخفيف في أن الخلايا السرطانية لم يكن لديك على التكيف مع النمو في المكروية الأجنبية ، الأمر الذي قد يقلل الذاتي تجديد الخلايا تردد ^{9 و 10.} بالإضافة إلى ذلك ، واحدة وقد تم زرع الخلايا بنجاح باستخدام الزرد مسانج ⁽⁸⁾ وعدة مئات من الحيوانات ويمكن بسهولة واقتصاديا زرع في وقت واحد ، وكلاهما يعمل على تقديم تقديرات أكثر دقة للتجديد الذاتي تردد الخلية.

هنا ، يقدم وسيلة لخلق الابتدائية ، T - الخلية fluorescently الحادة التي تحمل علامات سرطان الدم الليمفاوي (T - ALL) في مسانج الزرد ، وزرع هذه الأورام في الحد من التخفيف في الأسماك البالغة لتحديد الذاتي تجديد تردد الخلية. بينما يرد اللوكيميا كمثال ، فإن هذا البروتوكول هو مناسبة لتحديد وتيرة نشر ورم الخلايا باستخدام أي نموذج السرطان في الزرد.

Protocol

1. microinjection الحمض النووي للأجنة الزرد

1. يصبح خطي rag2 : لهضم كل 10μg البلازميد مع NOTI عند 37 درجة مئوية خلال الليل يبني GFP الحمض النووي ⁽¹¹⁾ : cMyc وrag2 : :.
2. الفينول : استخراج الكلوروفورم ويعجل البلازميدات وresuspend في كل من ₂ 20μL O. H
3. تحديد تركيز الحمض النووي عن طريق تشغيل تخفيف 1:1 ، 1:05 و 1:10 من هضم كل البلازميد على agarose هلام 1 ٪ مع 10μL ، و20μL 5μL من سلم ال DNA عالية المدى. هذا النوع من القياس الكمي عموما أكثر دقة من قراءة مطياف.
4. يخفف من تركيز الحمض النووي للنهائي في 60ng/μL 1M بوكل TE X +0.5 للحقن في سلالة - CG1 (أو سلالة مسانج أخرى) باستخدام الأجنة الزرد 30ng/μL rag2 : cMyc + 30ng/μL rag2 : GFP.
5. وينبغي إجراء الحقن كما أثبتت في السابق ^{12 ، 13.} باختصار ، يتم تعيين الزرد الذكور والإناث حتى في غرف التزاوج الليلة قبل الحقن. في يوم من الحقن ، ويتم تحميل الحمض النووي في إبرة الحقن ، ويتم ضبط الضغط بحيث يتم طرد فقاعة بقطر 50μm (30pg DNA) ، والتي تقاس بواسطة ميكرون المرحلة. ثم يتم حقن الأجنة في مرحلة واحدة الخلية ، مع الحمض النووي يتم حقنه مباشرة في الخلية ، وليس في صفار البيض. البقاء للأجنة ويرقات CG1 حقن عادة ما يكون ضعيفا ، و 5 ٪ فقط من الأسماك ستضم بنجاح التحوير ، وبالتالي ، ينبغي حقن> 600 الأجنة للتأكد من أن بعض الأسماك وتطوير اللوكيميا.
6. تخزين الأجنة المحقونة في 28.5 درجة مئوية ، وإزالة أجنة ميتة بعد 24hr. ثم يتم نقل الحيوانات إلى خزانات كبيرة في 5 أيام من الحياة ورفعت ¹⁴ كما هو موضح سابقا.

2. الكشف عن T - ALL الابتدائية في يرقات الزرد

1. ما يقرب من 28 يوما بعد الحقن ، وتخدير اليرقات الزرد بإضافة 200μL من 4ng / م Tricane - S 25mL لنظام المياه الأسماك في طبق بتري.
2. دراسة اليرقات من أجل التنمية المسمى - T - ALL fluorescently باستخدام المجهر epifluorescence في 20X التكبير ، وذلك باستخدام طول موجي الإثارة وانبعاث 485/20 530/25 تصفية للكشف عن GFP مضان (الشكل 1).
3. فصل اليرقات الورم إيجابية من تلك التي هي سلبية. يمكن فحص اليرقات عند نقطة سلبية وقت لاحق ، مرة واحدة قد نمت بشكل اكبر الاورام ، لضمان عدم إهمال أي تي جميع الأسماك إيجابية.
4. رصد T - ALL الأسماك إيجابية على الأقل مرة واحدة في الأسبوع باستخدام المجهر epifluorescence لتتبع نمو الورم.

3. عزل وتنقية fluorescently المسمى خلايا اللوكيميا الابتدائي

1. عندما خلايا اللوكيميا GFP إيجابية تجاوزت> 50 ٪ من الحيوانات ، والأسماك التضحية بإضافة 1mL من 4ng/mL Tricane - S في طبق بتري تحتوي على نظام المياه 9mL الأسماك.
2. ضع السمك في طبق بتري جديدة تحتوي على 1mL 0.9X برنامج تلفزيوني مع 5 ٪ مصل بقري جنيني للتخفيف من الخلايا. نقع السمك مع الماصة الحلاقة ، شفرة الخليط إلى فصل كتل زنزانة كبيرة ، ثم تمرير الخلايا من خلال مصفاة شبكة 40μm في أنبوب 50mL. ليس من الضروري أن ننأى عن كتل داخل خلايا الأنسجة واحد.
3. 500μL الماصة للخلايا لأنبوب 4mL البوليسترين. إضافة 1μL يوديد propidium 1mg/mL (PI) ، والتي سوف تسمية الخلايا الميتة. الدوامة ، ثم إبقاء الخلايا على الجليد.
4. تضحية من النوع البري CG1 الأسماك ، وأضعف في سلالة بنفس الطريقة المذكورة أعلاه لجمع الخلايا الطبيعية ، والتي تكون بمثابة الناقل للخلايا الورم خلال FBS 4mL 5 ٪ transplant.Add في برنامج تلفزيوني 0.9X إلى أنبوب 50mL لما مجموعه حجم 5mL.
5. عد الخلايا الطبيعية ، وإلى تمييع 3x10 ⁵ خلايا / مل في FBS 5 ٪ في برنامج تلفزيوني 0.9X ، ثم 100μL/well الماصة لوحة 96 - جيدا.
6. الإسفار باستخدام فارز الخلايا المنشطة (FACS) ، فرز GFP ، PI إيجابية الخلايا السرطانية السلبية (الشكل 2A ، B) في لوحة 96 - جيدا تحتوي على خلايا الدم في الجرعات التالية : 10 خلية / إضافة إلى 48 بئرا ، و 100 خلية / جيد في 24 بئرا ، 1000 خلية / إضافة إلى 12 بئرا ، وخلايا 10000 / إضافة إلى 6 آبار. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي أن يتم فرز الخلايا في 10000 بئر بدون خلايا الدم العادية ، وreanalyzed باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لتقييم الجدوى والنقاء من الخلايا مرتبة (الشكل 2C).

4. الحد من عمليات الزرع في التخفيف الزرد الكبار

1. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لوحة 96 - جيدا في 2000xg لمدة 10 دقيقة.
2. إزالة 95μL من طاف وresuspend الخلايا في 5μL المتبقية.
3. عقد الكبار (> 60 يوما) مسانج الجانب البطني حتى الزرد ، وحقن تعليق خلية في التجويف البريتوني ، وذلك باستخدام 26G / 2 "حقنة صغيرة. الزرد لا بد من تخدير قبل الزرع. يتم زرعها عادة ، يتم زراعة 45 السمك مع خلايا اللوكيميا 10 ، وزرع 20 مع 100 خلية ، يتم زرع خلايا 7 مع 1000 والسمك 5 مع الخلايا T - ALL 10000.

5. تحليل لتحديد سرطان الدم ، بدء تواتر الخلية

1. ما يقرب من 28 يوما بعد الزرع ، ودراسة مع الأسماك المزروعة باستخدام مجهر epifluoresence طول موجة الإثارة وانبعاث 485/20 530/25 تصفية للكشف عن GFP مضان. تسجيل عدد من الأسماك ايجابية في عدد من الأسماك حقن.
2. إعادة النظر في الأسماك كل 14 يوما لمدة تصل إلى 90 يوما ، وتسجيل عدد من الأسماك إيجابية. عندما سمكة الورم إيجابية تصبح المحتضرة ، التضحية الحيوانية Tricane - S جرعة زائدة.
3. إدخال النتائج في الجدول ، كما هو مبين في الشكل 3D. تحميل البيانات في ELDA على شبكة الإنترنت (المتطرفة تحليل التخفيف الحد) في البرامج الإحصائية http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html ¹⁵ ، والذي يستخدم تكرار الورم الحيوانات الايجابية والسلبية في كل جرعة زرع لتحديد تواتر الذاتي تجديد خلايا اللوكيميا داخل ALL - T الأساسي.

6. ممثل النتائج :

microinjection الحمض النووي في الأجنة من الأسماك مسانج غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة من أجنة المحقون مع <60 ٪ من الأجنة على قيد الحياة لمدة 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك ، بقاء الأسماك مسانج حقن عموما فقراء خلال نمو اليرقات ، مع كثير من الأحيان <20 ٪ الباقين على قيد الحياة لمدة 28 يوما. ولذلك فمن المهم لحقن عدد كبير من الأجنة من أجل خلق الأسماك المعدلة وراثيا التي من شأنها تطوير T - ALL.

كمثال على ذلك ، تم حقن الاجنة سلالة CG1 مع rag2 : cMyc + rag2 : GFP. والجينات المحورة في الجنين النامية شارك فصل ، بحيث أن كل خلية عن GFP وأعرب أيضا عن cMyc. كما تم عرض ليرقات الأولية T - ALL بعد 28 يوما (الشكل 1). وقد أظهرت الأعمال السابقة أن حوالي 5 ٪ من الأسماك حقن سيكون GFP إيجابية لخلايا تي داخل هذه الغدة الصعترية (الشكل 1) ، و 100 ٪ من هذه الأسماك وتطوير سرطان الدم حيث تصبح الخلايا T - ¹¹ المحولة. في حين أن نسبة ضئيلة من الزرد سرطان الدم قد يكون أكثر تقدما من السهل جدا للكشف في اليوم 28 ، ومعظم سوف يكون لها سوى GFP إيجابية الغدة الصعترية (الشكل 1) ، يجب أن تدرس على حدة بحيث اليرقات تحت التكبير عالية لضمان أن تكون جميع إيجابية ويتم اختيار الأسماك. GFP - T - ALL إيجابية الخلايا ستتفوق> 50 ٪ من الحيوانات ما بين 45-70 يوما.

في المثال المقدمة ، وتمت التضحية الزرد في 65 يوما من الحياة ، وكانت معزولة خلايا اللوكيميا وFACS فرزها للحد من زراعة التخفيف. تم فرز الخلايا التي كانت واحدة يوديد propidium السلبية والإيجابية GFP (الشكل 2) في لوحة 96 - جيدا. وقد تم إعادة تحليل الخلايا على 10000 فرزها بغية تقييم جدوى (مثالي> 95 ٪) والنقاء (مثالي> 92 ٪ ، الشكل 2). زرع T - ALLS تنشأ عموما قبل 28 يوما ، ولكن بعض الأورام قد يستغرق أكثر من 60 يوما لتطوير. في هذا المثال ، في اليوم 28 ، شوهد الأورام مرحلة مبكرة كمجال للGFP إيجابية الخلايا بالقرب من موقع الحقن (الشكل 3B) ، في حين أن بعض ALLS تي كانت أكثر تقدما ، بعد أن توسعت لملء التجويف البريتوني (الشكل 3C) . وتظهر البيانات من الحد المقايسات التخفيف من زرع الخلايا الأولية الثلاثة مختلفة T - 3D ALLS في الشكل. لهذه التجارب ، وقد تم زرع أكثر من 220 حيوان ، والتي يمكن إنجازها بسهولة من قبل شخص واحد في غضون عدة ساعات. وأظهر تحليل البيانات باستخدام البرمجيات التي ELDA ، في المتوسط ​​، 1 في 135 T - ALL الزنزانات الذاتي تجديد خلايا اللوكيميا ، نشر (الشكل 3E).

كما تم عرض للنمو سرطان الدم الأولية 28 يوما بعد الحقن الشكل 1 يرقات اسماك الزرد حقنه في مرحلة واحدة مع خلية خرقة : : : - cMyc + خرقة - eGFP :. وكان السمك (*) GFP إيجابية خلايا تي في الغدة الصعترية ، وهذا السمك ستطور T - ALL باسم خلايا تي أصبحت تتحول مع مرور الوقت. هذه المرحلة هو أمر شائع جدا في اليوم 28. وكان احد الأسماك (**) متقدمة T - ALL الذي انتشر في الأنسجة اللينة. المتبقيين الأسماك هي سلبية للنمو الورم. لقد التقطت الصورة في التكبير 16X.

الشكل 2. Fluorescently المسمى T - ALL تم فرز الخلايا من الحيوانات المريضة واستخدمت في تخفيف مقايسة الحد زرع الخلايا. أولا ، وضعت بوابة واحدة لتحديد الخلايا (اللوحة اليسرى العليا) ، ثم يتم اختيار خلايا يوديد propidium السلبية (اللوحة اليسرى وسط). أخيرا ، وضعت بوابة لتحديد فقط GFP إيجابية للفرز خلايا اللوكيميا (اللوحة اليسرى السفلى). وينبغي أن يكون فرز الخلايا reanalyzed لتقييم سلامة ونقاء قبل الزرع (لوحات اليمين).

الشكل 3. فحصت اسماك الزرد لنمو سرطان الدم 28 يوما بعد الزرع. الأسماك هي الورم إما NEGاطر النسبية (A) ، وورم صغير المتزايدة في موقع الحقن (B) ، أو لديك سرطان الدم تقدما (C). والتقطت هذه الصور في التكبير 7X. يتم تسجيل عدد من سرطان الدم إيجابية الأسماك في عدد من الأسماك المزروعة في كل التخفيف ، كما في (D). يتم إدخال البيانات في برنامج ELDA على شبكة الإنترنت لحساب عدد الذاتي تجديد خلايا اللوكيميا والعلوية والسفلية فترات الثقة 95 ٪ (E).

Discussion

ان نقطة القوة الرئيسية لاستخدام الزرد في أبحاث السرطان والتي يمكن استخدامها أعداد كبيرة من الحيوانات وبتكلفة منخفضة نسبيا. وهذا أمر مهم لا سيما في مجال الحد المقايسات تخفيف زرع الخلايا ، التي تستخدم فيها نسب من الحيوانات التي تطور الأورام المزروعة إلى العدد الإجمالي لتحديد زرع ورم بدء تواتر الخلية. في أسلوب المعروضة هنا ، وتستخدم أكثر من 70 عملية زرع الحيوانات المتلقي في مقايسة ، وتقديم تقدير دقيق لعدد خلايا الورم نشر. وينبغي أن يكون الأمثل كلا من عدد الحيوانات المستخدمة وجرعة من الخلايا السرطانية المزروعة لنموذج معين السرطان ، على سبيل المثال ، إذا تبين التجارب الأولية للورم الخلايا بدء نادرة ، قد تكون مفيدة زرع جرعات 100000 ، 50000 ، 10000 و 1000 في الخلايا زرع.

مسانج سلالات الزرد مفيدة في الحد من تحليل التخفيف. ومع ذلك ، لم يتم حتى الآن هذه السلالات التي يشيع استخدامها في جميع المختبرات ، وبعض النماذج من سرطان الزرد وجود لها إلا في الأسماك خيفي. يمكن إجراء عمليات زرع الخلايا الحد التخفيف في البرية من نوع السلالات التي خضعت الاجتثاث المناعي ، وإن كان من المحتمل أن يحسب تردد خلية الذاتي وتجديد 1-10 أضعاف أعلى مما لو استخدمت مسانج الزرد ^8. ومن المهم أن نلاحظ أنه ينبغي استخدام جرعات أكبر من الخلايا للزرع في غير مأمن المتلقين ، مطابقة للإشعاع ، وبعض الخلايا السرطانية لن يكتب له البقاء في زرع المكروية الأجنبية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من الأورام تبدأ في التراجع بعد 21 يوما عند الحيوان المتلقي النظام المناعي للشفاء ، لذا يجب أن يتم تقييم الحيوانات لنمو الورم في كل 7 أيام بعد الزرع.

الأساليب المقدمة هنا هي مناسبة للاستخدام مع أي نموذج سرطان الزرد ، وحتى الآن استخدمت لتحديد الورم بدء تردد في كل خلية تي خلية سرطان الدم الليمفاوي الحاد ⁸ ، ونموذجا الأورام الصلبة ، العضلية المخططة ^16. وfluorescently المسمى هذه الأورام عن طريق الحقن المشترك للأجنة مع الجين الورمي على حد سواء ، وعلامة فلوري ، لأن الحمض النووي المشترك تفصل ، أي خلية التعبير عن الجين الورمي وأعرب أيضا عن بروتين فلوري ^17. بينما يوصى مضان لأن يسهل تتبع نمو الورم دون الحاجة إلى التضحية الحيوانية ويوفر طريقة مباشرة إلى الأمام لعزل الخلايا السرطانية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية ، فإنه من الممكن تسمية الخلايا السرطانية مع الأجسام المضادة للورم محددة لتسهيل صناع تنقية بهم ، على الرغم من الأجسام المضادة قد تلطيخ في الزرد تتطلب التحسين.

أخيرا ، مرة واحدة وقد تم تحديد حدوث ورم نشر خلايا الورم لنوع معين ، فمن الممكن استخدام هذه المقايسات لتحديد الآليات التي تحكم وتيرتها الخلية. على سبيل المثال ، يمكن علاج الخلايا السرطانية الأولية مع مثبطات محددة قبل تحديد مسار التخفيف زرع ، أو السمك يمكن زرعها مداوي أنفسهم مع المخدرات. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم التلاعب في الصفات الوراثية للأورام أنفسهم عن طريق حقن الأسماك مرحلة واحدة مع الخلية الجينات في المصالح ، بحيث يؤدي الأورام الابتدائية والافراط في التعبير عن الجينات. في هذه التجارب ، سوف يلاحظ أي تأثير على تجديد الذات وتيرة خلية في المقايسات تخفيف محدود.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	رقم كتالوج
NOTI تقييد انزيم	نيو إنجلاند Biolabs	R0189
الفينول : الكلوروفورم	EMD الكيميائية الحيوية	6805 - OP
5M بوكل	سيغما الدريخ	P9541
تريس 100X - EDTA	سيغما الدريخ	T9285
ارتفاع متوسط ​​سلم DNA	Fermentas	R0621
مسانج الزرد		مراجع 6-8
المصل البقري الجنين	Gibco	16000-036
Propidium التأيد	سيغما الدريخ	P4864
26G / 2 "Microsyringe	هاميلتون	80366
40μm مصفاة شبكة خلية	فالكون دينار بحريني	352340