Количественная Частота опухолей, распространяющихся ячеек с использованием Ограничение трансплантации Разбавление сотовый в сингенных данио рерио

Резюме

Ограничение разбавления анализов клеточной трансплантации используются для определения частоты опухолей, распространяющихся клеток. Этот протокол описывает метод генерации сингенных данио, которые развиваются флуоресцентно меченных лейкемии и детали, как изолировать и трансплантации этих клеток лейкемии на ограничение разведения в брюшную полость взрослых рыбок данио.

Аннотация

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis¹. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample^{2, 3}. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment.

Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease⁴. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression⁵. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies ^6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency^{9, 10}. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish⁸ and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.

Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

протокол

1. Микроинъекции ДНК эмбрионов данио рерио

1. Линеаризовать RAG2:: cMyc и RAG2:: GFP ¹¹ конструкции ДНК путем переваривания 10 мкг каждого плазмиду с NotI при температуре 37 ° С в течение ночи.
2. Фенол: хлороформ извлекать и осадок плазмиды, и ресуспендируют каждый в 20 мкл H ₂ O.
3. Определить концентрацию ДНК, запустив 1:1, 1:5 и 1:10 разбавления каждого переваривается плазмиды на 1% агарозном геле с 20 мкл, 10 мкл и 5 мкл высокой дальности ДНК лестнице. Этот тип количественное, как правило, более точны, чем спектрометр чтения.
4. Развести ДНК, чтобы конечная концентрация 60ng/μL в 1 М KCl 0,5 X TE для закачки в CG1-деформированного (или другой сингенных деформации) данио рерио использование эмбрионов 30ng/μL RAG2:: cMyc + 30ng/μL RAG2:: GFP.
5. Инъекции должны проводиться, как ранее продемонстрировали ^{12, 13.} Короче говоря, мужские и женские данио создаются в брачных камер ночь перед инъекцией. В день инъекции ДНК загружается в инъекционной иглой, давление регулируется так, чтобы пузырь с 50 мкм диаметром изгнаны (30pg ДНК), которая измеряется микрометр. Затем эмбрионы вводят на один-клеточной стадии, с ДНК, будучи впрыскивается непосредственно в камеру, а не в желтке. Выживание вводят CG1 эмбрионов и личинок, как правило, бедны, и только 5% рыбы будет успешно включить трансгенов, таким образом,> 600 эмбрионы должны быть введены, чтобы некоторые виды рыб будут развиваться лейкемия.
6. Магазин вводят эмбрионов на 28,5 ° С, и вывезти тела погибших эмбрионов после 24hr. Животные затем переведен в больших резервуарах на 5 дней жизни и вырос, как описано выше ^14.

2. Скрининг на первичном Т-ОЛЛ у данио личинки

1. Примерно через 28 дней после инъекции, анестезия личиночной данио, добавив 200 мкл 4ng / м Tricane-S для 25 мл рыбы водопроводной сети в чашке Петри.
2. Изучение личинок для развития флуоресцентно меченных Т-ОЛЛ с помощью epifluorescence микроскопом при увеличении 20X, используя 485/20 длины волны возбуждения и 530/25 выбросов фильтр для выявления GFP флуоресценции (рис. 1).
3. Отдельные положительные опухоли личинок из тех, которые носят негативный характер. Отрицательные личинки могут быть рассмотрены на более позднем этапе, когда опухоль может быть выросла еще больше, чтобы ни Т-ОЛЛ положительные рыбы были упущены.
4. Монитор Т-ОЛЛ положительные рыбу по крайней мере один раз в неделю, используя epifluorescence микроскопом, чтобы отслеживать рост опухоли.

3. Выделение и очистка флуоресцентно меченных первичных клеток лейкемии

1. Когда GFP-положительных клеток лейкемии обогнали> 50% животных, жертвенность рыбы, добавляя 1 мл 4ng/mL Tricane-S в чашке Петри содержащие 9mL рыбы воды в системе.
2. Место рыб в новое блюдо Петри, содержащую 1 мл 0,9 x PBS с 5% фетальной сыворотки говядине в буфер клеток. Размочите рыбы с бритвенным лезвием, пипетки смесь отделить большие скопления клетки, затем переходят клеток через 40 мкм фильтр сетки в 50 мл трубки. Не надо отделить все ткани скопления в одиночных камерах.
3. Внесите 500 мкл клеток к 4 мл трубки полистирола. Добавить 1 мкл 1mg/mL пропидий йодида (PI), который будет этикетке мертвых клеток. Vortex, а затем сохранить клетки на льду.
4. Жертва дикого типа CG1 рыбу, вымачивать и процедите в том же, как и выше собирать нормальные клетки, которые служат в качестве носителя для опухолевых клеток во время transplant.Add 4 мл 5% FBS в 0.9x PBS на 50 мл трубку для общего Объем 5 мл.
5. Граф нормальные клетки, разбавить до 3х10 ^{5 клеток} / мл в 5% ЭТС в 0.9x PBS, затем пипеткой 100μL/well из 96-луночного планшета.
6. Использование флуоресценции Активированный сотовый Сортировщик (FACS), сортировать GFP положительные, П. И. отрицательные опухолевые клетки (рис. 2а, б) в 96-луночного планшета содержащих клеток крови в следующих дозах: 10 клеток / лунку в 48 скважин, 100 клеток / лунку на 24 скважинах, 1000 клеток / лунку на 12 скважинах, и 10000 клеток / лунку на 6 скважинах. Кроме того, 10000 клеток должны быть отсортированы в колодец без нормальные клетки крови, и проанализировать повторно использованием FACS для оценки чистоты и жизнеспособности отсортированные клетки (рис. 2С).

4. Ограничение разбавления трансплантацию во взрослых данио

1. Гранул клетки центрифугированием 96-луночного планшета на 2000xg течение 10 минут.
2. Удалить из 95μL супернатант и ресуспендирования клеток в оставшиеся 5 мкл.
3. Держите взрослых (> 60 дней) сингенных данио вентральной стороной вверх, и ввести суспензии клеток в брюшную полость, используя 26G / 2 "микро-шприца. Данио рерио не должны быть анестезии до трансплантации. Как правило, 45 рыб пересаживают с 10 клеток лейкемии, 20 пересаживают с 100 клеток, 7 пересаживают с 1000 клеток и 5 рыб пересаживают с 10000 Т-ОЛЛ клетки.

5. Анализ для определения лейкемии, инициирующие ячейки частоты

1. Примерно через 28 дней после пересадки, изучить пересаженной рыбы с использованием микроскопа epifluoresence 485/20 длины волны возбуждения и 530/25 выбросов фильтр для выявления GFP флуоресценции. Запись ряд позитивных рыбы в общей численности рыб вводили.
2. Пересмотреть рыбы каждые 14 дней до 90 дней и записывать число положительных рыбы. Когда опухоль-положительных рыба стала умирающей, жертву животного Tricane-S передозировки.
3. Входной результаты в таблицу, как показано на рисунке 3D. Загрузить данные в веб-ELDA (Extreme предельного разбавления анализ) статистического программного обеспечения в http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html ^15, который использует частоту опухолей положительных и отрицательных животных каждая пересадка дозы, чтобы определить частоту самообновлению лейкозных клеток в первичных Т-ОЛЛ.

6. Представитель Результаты:

ДНК микроинъекции в эмбрионы из сингенных рыбы часто приводит к низкой выживаемости вводят эмбрионы, с <60% выживших эмбрионов в течение 24 часов. Кроме того, выживаемость вводят сингенных рыбы, как правило, бедные во время развития личинок, чаще всего с <20% выживших в течение 28 дней. Поэтому важно, чтобы ввести большое количество эмбрионов для создания трансгенных рыб, которые будут развиваться Т-ОЛЛ.

В качестве примера, CG1 эмбрионов штамм вводили RAG2:: cMyc + RAG2:: GFP. Трансгенов совместного разделения в развивающийся эмбрион, так что каждая клетка, выражающая GFP также выразить cMyc. Личинки были обследованы на наличие первичных Т-ОЛЛ через 28 дней (рис. 1). Предыдущая работа показала, что около 5% введенной рыба будет иметь GFP-положительных Т-клеток в пределах их тимуса (рис. 1), и 100% этих рыб будет развиваться лейкемия, как Т-клетки превращаются ^11. Хотя небольшая часть данио рерио могут иметь более продвинутые лейкемии, которая очень легко обнаружить на 28-й день, большинство будет иметь только GFP-положительных вилочковой железы (рис. 1), поэтому личинки должны быть рассмотрены индивидуально при большом увеличении, чтобы гарантировать, что все положительные рыба выбрана. GFP-положительных Т-ОЛЛ клетки обгонит> 50% животных между днями 45-70.

В примере, при условии, данио были принесены в жертву на 65 дней жизни, и лейкозных клеток были выделены и FACS отсортированных для ограничения разведения трансплантации. Отдельные клетки, которые были пропидий йодида отрицательным и GFP-положительных (рис. 2) были разбиты на 96-луночного планшета. Повторный анализ был сделан на 10000 отсортированы клетки для оценки жизнеспособности (в идеале> 95%) и чистота (в идеале> 92%, рис 2). Пересаженные Т-Аллс как правило, возникает до 28 дней, но некоторые опухоли может занять более 60 дней, чтобы развиваться. В этом примере, на 28-й день, рано опухолей стадии рассматривались как область GFP-положительных клеток вблизи места инъекции (рис. 3б), а некоторые Т-Аллс были более прогрессировала, расширив для заполнения брюшной полости (рис. 3C) . Данные предельного разбавления анализов клеточной трансплантации из трех различных первичных Т-Аллс показаны на рисунке 3D. Для этих экспериментов, более 220 животных были пересажены, которые могут быть легко выполнены одним человеком в течение нескольких часов. Данные анализа с использованием программного обеспечения ELDA показали, что, в среднем, 1 на 135 Т-ОЛЛ клетки самообновлению лейкемии распространяющиеся клетки (рис. 3Е).

Рисунок 1 данио рерио личинки вводится на один-клеточной стадии с тряпкой.::-CMyc + тряпка::-EGFP были обследованы на первичном рост лейкемии 28 дней после инъекции. Рыба (*) была GFP-положительных Т-клеток в тимусе; эта рыба будет развиваться Т-ОЛЛ, как Т-клетки превращаются с течением времени. Этот этап является очень распространенным явлением в 28-й день. Одна рыба (**) были передовые Т-ОЛЛ, который распространился в мягкие ткани. Остальные две рыбы отрицательный рост опухоли. Изображение было получено при 16X увеличением.

Рисунок 2. Флуоресцентно меченных Т-ОЛЛ клетки сортируются от больных животных и использовали в предельном разбавлении анализа клеточной трансплантации. Во-первых, ворот было обращено на выбор отдельных клеток (верхняя левая панель), то пропидий йодида отрицательные клетки отбирают (в центре слева). Наконец, ворота был разработан, чтобы выбрать только GFP-положительных клеток лейкемии для сортировки (нижняя левая панель). Сортировать клетки должны быть переосмыслены для оценки жизнеспособности и чистоты перед пересадкой (правая панель).

Рисунок 3. Данио рерио были исследованы на лейкоз роста через 28 дней после пересадки. Рыба либо опухоль негative (), имеют небольшую опухоль растет на месте инъекции (B), или прогрессировала лейкоз (С). Изображения были приняты на 7X увеличения. Общее число лейкемией-положительных рыбы в общей численности рыбы пересаженные на каждое разведение записывается, как и в (D). Данные вводятся в веб-программы ELDA рассчитать число самообновлению клеток лейкемии и верхних и нижних 95% доверительный интервал (E).

Обсуждение

Одна из основных сильных использованием данио в исследовании рака является то, что большое количество животных могут быть использованы при относительно низких затратах. Это особенно важно в ограничении разведения клеточной трансплантации анализов, где пропорции трансплантированных животных, которые развиваются опухоли к общему числу пересаженных используются для определения опухоль начала ячейки частоты. В метод, представленный здесь, более 70 животных пересадка получателя используются в анализе, обеспечивая точную оценку опухоль распространяется числа клеток. Оба числа животных, используемых и дозы опухолевых клеток пересаженного должен быть оптимизирован для данной модели рака, например, если начальные эксперименты показывают, опухоли, инициирующие клетки встречаются редко, полезной дозы пересадки может быть 100 000, 50000, 10000 и 1000 клеток на трансплантата.

Сингенных штаммов данио полезны в ограничении разведения анализа. Однако, эти штаммы не часто используется во всех лабораториях, а некоторые модели данио рака существуют только в аллогенных рыбы. Ограничение трансплантации разбавления клетки может быть выполнена в штаммов дикого типа, которые подверглись иммунной абляции, хотя самообновлению ячейки частота может быть рассчитана как 10-100 раз выше, чем если бы сингенных данио были использованы ^8. Важно отметить, что в больших дозах клеток должны быть использованы для трансплантации в неиммунных совпадают, облученных реципиентов, так как некоторые опухолевые клетки не выживет пересадки на иностранный микроокружения. Кроме того, многие опухоли начнут регрессировать после 21 дней, когда иммунная система получателя животного восстанавливается, так что животные должны быть оценены для роста опухоли каждые 7 дней после пересадки.

Методы, представленные здесь, являются подходящими для использования с любыми данио модели рака, и до сих пор используется, чтобы определить опухоль начала ячейки частотой в обеих Т-клеточного острого лимфобластного лейкоза ⁸ и твердотельной модели опухоли, рабдомиосаркома ^16. Эти опухоли были помечены флуоресцентно совместного введения эмбрионов с обеих онкогенов и флуоресцентного маркера, потому что ДНК со-сегрегации, любой ячейке выражения онкоген также выразить флуоресцентный белок ^17. Хотя флуоресценции рекомендуется, поскольку это облегчает отслеживание роста опухоли без необходимости жертвовать животных и обеспечивает прямой вперед способ изолировать опухолевых клеток путем FACS, можно маркировать опухолевых клеток с антителами к опухоли конкретных производителей для облегчения их очистки , хотя антитела окрашивания в данио рерио могут требовать оптимизации.

Наконец, когда частота опухолей, распространяющихся клеток было определено для данного типа опухоли, можно использовать эти анализы для выявления механизмов, которые управляют их ячейки частоты. Например, клетки первичной опухоли можно лечить с помощью специфических ингибиторов путь до предельного разбавления трансплантации, или пересаженной рыбы сами по себе могут быть дозированным с наркотиками. Кроме того, генетики опухолей сами по себе могут манипулировать, вводя один-клеточной стадии рыбы с интересующего гена, так что в результате первичной опухоли будет более-экспресс гена. В этих опытах, никакого влияния на самообновлению ячейки частоты будет наблюдаться в предельных тестах разбавления.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
NotI рестрикции	New England Biolabs	R0189
Фенол: Хлороформ	EMD Biochemicals	6805-OP
5M KCl	Sigma-Aldrich	P9541
100X Трис-ЭДТА	Sigma-Aldrich	T9285
Высокая лестница ДНК Диапазон	Fermentas	R0621
Сингенных данио		Литература 6-8
Эмбриональной телячьей сыворотки	Гибко	16000-036
Пропидия йодидом	Sigma-Aldrich	P4864
26G / 2 "микрошприца	Гамильтон	80366
40 мкм ячейки сетки фильтра	BD Сокол	352340