Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

Resumen

Limitación de la dilución ensayos de trasplante de células se utilizan para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células. Este protocolo describe un método para generar pez cebra singénico que desarrollan leucemia fluorescente marcado y los detalles de cómo aislar y trasplante de estas células de leucemia en la limitación de dilución en la cavidad peritoneal de los adultos de pez cebra.

Resumen

Autorrenovables las células cancerosas son los tipos de células sólo dentro de un tumor que tiene una capacidad ilimitada para promover el crecimiento del tumor, y por lo tanto conocido como tumor de propagación células o células iniciadoras del tumor. Se cree que la orientación de estas células de auto-renovación de destrucción bloquear la progresión del tumor y detener la recaída, lo que mejora el pronóstico del paciente ^1. La manera más común para determinar la frecuencia de auto-renovación de células de un tumor es una célula de ensayo de transplante de dilución límite, en el que las células tumorales son trasplantadas a animales receptores en dosis cada vez mayores, la proporción de animales que se desarrollan los tumores se utiliza el cálculo del número de auto-renovación de células en la muestra original del tumor ^{2, 3.} Lo ideal sería que una gran cantidad de animales podrían ser utilizados en cada experimento de dilución limitante para determinar con exactitud la frecuencia de los tumores se propagan las células. Sin embargo, experimentos a gran escala con ratones son costosos, y la mayoría de limitar los ensayos de dilución de uso sólo 10-15 ratones por experimento.

Pez cebra se han destacado como un modelo de cáncer, en gran parte debido a su facilidad de manipulación genética y la economía por el que los experimentos a gran escala puede llevar a cabo. Además, los tipos de cáncer modelo de pez cebra se han encontrado para imitar a sus ^cuatro contraparte enfermedades humanas. A pesar de que es posible trasplantar células tumorales de un pez a otro sub-letales de la irradiación de los animales receptores, la regeneración del sistema inmunológico después de 21 días a menudo causa la regresión del tumor ^5. La reciente creación de pez cebra singénico ha facilitado en gran medida los estudios tumor trasplante ^6-8. Debido a que estos animales son genéticamente idénticos, se implantan las células del tumor trasplantado con firmeza en los peces receptores, y el crecimiento del tumor se puede controlar durante largos períodos de tiempo. Singénico pez cebra es ideal para limitar los ensayos de dilución en el trasplante de células tumorales que no tienen que adaptarse al crecimiento en un microambiente extranjeros, lo que puede subestimar la auto-renovación de la frecuencia de ^{9 celdas, 10.} Además, una trasplantes de células se han completado con éxito el uso de pez cebra singénico ⁸ y varios cientos de animales puede ser fácil y económicamente trasplantados al mismo tiempo, los cuales sirven para proporcionar una estimación más precisa de la auto-renovación de la frecuencia de la célula.

Aquí, se presenta un método para la creación de primaria, con fluorescencia marcado de células T leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) en el pez cebra singénico, y el trasplante de estos tumores en la limitación de dilución en los peces adultos para determinar la frecuencia de auto-renovación celular. Mientras que la leucemia se presenta como un ejemplo, este protocolo es adecuado para determinar la frecuencia de los tumores se propagan las células utilizando cualquier modelo de cáncer en el pez cebra.

Protocolo

1. Microinyección de ADN embriones de pez cebra

1. Linealizar RAG2:: cMYC y RAG2:: GFP ¹¹ construcciones de ADN mediante la digestión de 10μg de cada plásmido con NotI a 37 ° C durante la noche.
2. Fenol: extracto de cloroformo y precipitado los plásmidos, y resuspender en 20μL de cada H ₂ O.
3. Determinar la concentración del ADN mediante la ejecución de una dilución 1:01, 1:05 y 1:10 de cada plásmido digerido en un 1% en gel de agarosa con 20μL, 10μL y 5μL de una escalera de ADN de alto rango. Este tipo de cuantificación es generalmente más exacto que una lectura del espectrómetro.
4. Diluir el ADN a una concentración final de KCl 1M en 60ng/μL TE 0,5 X para la inyección en CG1-deformación (o tensión singénico otros) embriones de pez cebra con 30ng/μL RAG2:: cMYC + 30ng/μL RAG2:: GFP.
5. Las inyecciones se deben realizar como se ha demostrado ^{12, 13.} En pocas palabras, el pez cebra macho y hembra se establecen en las cámaras de apareamiento de la noche antes de la inyección. En el día de la inyección, el ADN está cargado en la aguja de inyección, la presión se ajusta de modo que una burbuja con un diámetro de 50 micras es expulsado (30pg ADN), que se mide con un micrómetro. Luego, los embriones se inyectan en el estadio de una célula, con el ADN que se inyecta directamente en la célula, y no en la yema. La supervivencia de la inyección CG1 embriones y larvas es generalmente pobre, y sólo el 5% de los peces con éxito incorporar el transgén, por lo que> 600 embriones se debe inyectar para asegurarse de que algunos peces se desarrollan leucemia.
6. Almacenar los embriones inyectados a 28,5 ° C, y la toma de embriones muertos después de las 24 horas. Los animales se transfieren a los tanques grandes con 5 días de la vida y criado como se ha descrito anteriormente ^14.

2. La detección de T-ALL primaria en larvas de pez cebra

1. Aproximadamente 28 días después de la inyección, anestesia larvas de pez cebra mediante la adición de 200μL de 4NG / m Tricane-S a 25 ml de peces de agua del sistema en una placa de Petri.
2. Examinar las larvas para el desarrollo de fluorescencia con etiqueta T-ALL por el uso de un microscopio de epifluorescencia a 20X, con una longitud de onda de excitación y de emisión de 485/20 530/25 filtro para detectar la fluorescencia de GFP (Figura 1).
3. Separados larvas tumor positivo de aquellos que son negativos. Larvas negativas pueden ser examinadas en un momento posterior, una vez que los tumores pueden haber crecido más, para asegurarse de que no T-ALL FISH positivo se perdieron.
4. Monitor de T-ALL FISH positivo al menos una vez a la semana usando el microscopio de epifluorescencia para seguir el crecimiento del tumor.

3. Aislamiento y purificación de células marcadas con fluorescencia leucemia primaria

1. Cuando GFP-positivas células leucémicas se han superado a> 50% de los animales, el sacrificio de los peces mediante la adición de 1 ml de 4ng/mL Tricane-S en una placa de Petri que contiene 9 ml de agua del sistema de pescado.
2. Coloque el pescado en una nueva placa de Petri que contiene 1 ml de 0.9x PBS con suero bovino fetal al 5% de amortiguamiento de las células. Macerar el pescado con una hoja de afeitar, pipeta de la mezcla de disociar grupos de células grandes, a continuación, pasar a las células a través de un colador de malla 40μm en un tubo de 50 ml. No es necesario disociar todos los grupos de tejidos en células individuales.
3. 500μL pipeta de las células a un tubo de poliestireno de 4 ml. Añadir 1μL 1mg/ml yoduro de propidio (PI), que marca las células muertas. Vortex, a continuación, mantener las células en hielo.
4. Sacrificar una de tipo salvaje CG1 pescado, macerado y la tensión de la misma manera que antes de recoger las células normales, que sirven como soporte para las células del tumor durante transplant.Add 4 ml 5% de SFB en PBS a 0,9 veces el tubo de 50 ml, para un total volumen de 5 ml.
5. Contar con las células normales, se diluye hasta 3x10 ⁵ células / ml en FBS al 5% en PBS 0,9 x, entonces 100μL/well pipeta de una placa de 96 pocillos.
6. El uso de un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS), más o menos las buenas prácticas agrarias de células positivas, PI tumor negativo (Figura 2A, B) en la placa de 96 pozos que contienen células de la sangre en las siguientes dosis: 10 células / pocillo en 48 pozos, 100 células / en 24 pozos, 1000 células / pocillo en 12 pozos, y las células 10.000 / 6 y en los pozos. Además, 10.000 células deben ser ordenados en un pozo sin células sanguíneas normales, y volver a analizar el uso FACS para evaluar la pureza y la viabilidad de las células ordenada (Figura 2C).

4. Limitar la dilución en el trasplante de adultos de pez cebra

1. Precipitar las células por centrifugación de la placa de 96 pozos en 2000xg durante 10 minutos.
2. Quitar 95μL del sobrenadante y se resuspenden las células en el 5μL restantes.
3. Mantenga un adulto (> 60 días) singénico parte ventral del pez cebra, y se inyecta la suspensión de células en la cavidad peritoneal, utilizando un 26G / 2 "micro-jeringa. Pez cebra no tiene que ser anestesiados antes del trasplante. Generalmente, el 45 de pescado se trasplantan con 10 células de leucemia, 20 son trasplantados con 100 celdas, 7 son trasplantados con células de 1000 y los peces 5 se trasplantan con 10.000 T-todas las células.

5. Análisis para determinar la leucemia de células iniciadoras de la frecuencia

1. Aproximadamente 28 días después del trasplante, examinar el pescado trasplantados con un microscopio con una longitud de onda epifluoresence excitación 485/20 y 530/25 de emisión de filtro para detectar la fluorescencia de GFP. Anote el número de peces positivos por el número total de peces inyectados.
2. Volver a examinar el pescado cada 14 días hasta 90 días y registrar el número de peces positivos. Cuando un pez de tumores positivos se convierten en moribundo, el sacrificio del animal por Tricane-S sobredosis.
3. De entrada los resultados en una tabla, como se muestra en la figura 3D. Cargar los datos en el ELDA basado en la web (Extreme Análisis de dilución limitante) de software estadístico en http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html ^15, que utiliza la frecuencia de tumores animales positivos y negativos en cada dosis de trasplante para determinar la frecuencia de auto-renovación de las células de leucemia en el principal T-ALL.

6. Los resultados representativos:

Microinyección de ADN en embriones de pez singénico a menudo resulta en una baja tasa de supervivencia de los embriones inyectados, con <60% de los embriones sobreviven durante 24 horas. Además, la supervivencia de los peces singénico inyectada es generalmente pobre durante el desarrollo larvario, con frecuencia <20% de sobrevivir durante 28 días. Por eso es importante para inyectar un gran número de embriones con el fin de crear los peces transgénicos que se desarrollará la LLA-T.

A modo de ejemplo, CG1 embriones fueron inyectados con cepa RAG2:: cMYC + RAG2:: GFP. Los transgenes co-segregan en el embrión en desarrollo, de manera que cada célula que expresa GFP también se expresa cMYC. Las larvas fueron seleccionados para la primaria de la LLA-T después de 28 días (Figura 1). Trabajos anteriores han demostrado que aproximadamente el 5% de los peces inyectados se han GFP-positivas las células T en su timo (Figura 1), y el 100% de estos peces se desarrollan leucemia, las células T se transforman ^11. Mientras que una pequeña parte de pez cebra puede tener una leucemia más avanzada que es muy fácil de detectar a los 28 días más, sólo tendrá un GFP-positivas del timo (Figura 1), por lo que las larvas deben ser examinados de forma individual con una lupa de alta para asegurarse de que todos los positivos los peces son seleccionados. GFP-T positivas las células de LLA superará> 50% de los animales entre los días 45-70.

En el ejemplo citado, el pez cebra fueron sacrificados a los 65 días de vida, y las células de leucemia que estaban aisladas y FACS ordenados para limitar el trasplante de dilución. Las células individuales que se yoduro de propidio negativas y positivas-GFP (Figura 2) se clasificaron en una placa de 96 pocillos. Reanálisis se hizo en 10.000 células seleccionadas con el fin de evaluar la viabilidad (lo ideal es> 95%) y la pureza (lo ideal es> 92%, Figura 2). Trasplantado T-ALL generalmente surgen antes de 28 días, pero algunos tumores pueden tener más de 60 días en desarrollarse. En este ejemplo, el día 28, los tumores en fase inicial fueron vistos como un área de buenas prácticas agrarias de células positivas a cerca del sitio de la inyección (Figura 3 B), mientras que algunos ONVOCATORIAS T-eran más avanzado, después de haber expandido para llenar la cavidad peritoneal (Figura 3 C) . Los datos de los ensayos de limitación de la dilución de trasplante de células a partir de tres diferentes principal T-ALL se muestran en la figura 3D. Para estos experimentos, más de 220 animales fueron trasplantados, lo que puede lograrse fácilmente por una persona en pocas horas. El análisis de datos utilizando el software ELDA mostró que, en promedio, 1 de cada 135 T-Todas las células se auto-renovación de la leucemia se propagan las células (Figura 3E).

Figura 1 larvas de pez cebra inyectados en el estadio de una célula con un trapo.::-CMYC + trapo::-eGFP fueron seleccionados para el crecimiento de la leucemia primaria 28 días después de la inyección. Pescado (*) había GFP-positivas las células T en el timo, este pez se desarrollará la LLA-T como las células T se transforman con el tiempo. Esta etapa es muy común en el día 28. Un pez (**) tenía un avanzado T-ALL que se ha diseminado a los tejidos blandos. Los otros dos peces son negativos para el crecimiento del tumor. La imagen fue tomada con un aumento de 16X.

Figura 2. Fluorescente marcada con T-ALL células fueron ordenados de animales enfermos y se utiliza en el ensayo de transplante de células de dilución limitante. En primer lugar, una puerta se elaboró ​​para seleccionar las células individuales (panel superior izquierdo), entonces las células del yoduro de propidio negativas son seleccionados (panel de la izquierda). Finalmente, una puerta se elaboró ​​para seleccionar sólo las buenas prácticas agrarias de células positivas para la clasificación de la leucemia (panel inferior izquierdo). Células seleccionadas deben ser vueltos a analizar para evaluar la viabilidad y la pureza antes del trasplante (paneles de la derecha).

Figura 3. Pez cebra fueron examinados para el crecimiento de la leucemia 28 días después del trasplante. Peces están tumor negcreativas (A), tiene un tumor pequeño que crece en el lugar de inyección (B), o una leucemia avanzado (C). Las imágenes fueron tomadas con un aumento de 7X. El número total de leucemia positiva de pescado por el número total de peces trasplantado en cada dilución se registra, como en (D). Los datos se introducen en el programa basado en la web ELDA para calcular el número de auto-renovación de células de la leucemia y la parte superior e inferior de confianza del 95% (E).

Discusión

Una de las principales de la utilización del pez cebra en la investigación del cáncer es que un gran número de animales se pueden utilizar a un costo relativamente bajo. Esto es especialmente importante en la limitación de los ensayos de dilución de trasplante de células, donde las proporciones de los animales trasplantados que desarrollan tumores en el número total de trasplantados se utilizan para determinar iniciadoras del tumor de células de frecuencia. En el método que aquí se presenta, más de 70 animales receptores de trasplante se utilizan por ensayo, proporcionando una estimación precisa del número de células tumorales se propagan. Tanto el número de animales utilizados y las dosis de las células tumorales trasplantadas deben ser optimizados para un modelo de cáncer dado, por ejemplo, si los experimentos iniciales muestran iniciadoras del tumor las células son poco frecuentes, las dosis pueden ser útiles trasplante de 100.000, 50.000, 10.000 y 1.000 células por trasplante.

Singénico cepas de pez cebra son útiles para limitar el análisis de dilución. Sin embargo, estas cepas no son todavía de uso común en todos los laboratorios, y algunos modelos de cáncer de pez cebra existen sólo en el pescado alogénico. Limitar trasplantes de células de dilución se puede realizar en las cepas salvajes que han sufrido la ablación inmune, aunque la frecuencia de auto-renovación de células se puede calcular como 10 a 100 veces mayor que si singénico pez cebra se utilizaron ^8. Es importante tener en cuenta que una mayor dosis de células deben ser utilizados para trasplantes en receptores no inmunes encontrados, irradiado, ya que algunas células del tumor no va a sobrevivir el trasplante en un micro exterior. Además, muchos tumores comenzará a regresar después de 21 días, cuando el sistema inmune del animal receptor se recupera, por lo que los animales deben ser evaluados para el crecimiento del tumor cada 7 días después del trasplante.

Los métodos presentados aquí son adecuadas para su uso con cualquier modelo de cáncer de pez cebra, y hasta ahora han sido utilizados para determinar iniciadoras del tumor de células, tanto en la frecuencia de células T leucemia linfoblástica aguda, ^8, y un modelo de tumor sólido, rabdomiosarcoma ^16. Estos tumores fueron etiquetados con fluorescencia mediante la co-inyección de embriones con ambos un oncogen y un marcador fluorescente, ya que el ADN co-segrega, los celulares que expresan el oncogén también expresan la proteína fluorescente ^17. Mientras que la fluorescencia es recomendable porque facilita el seguimiento del crecimiento del tumor sin necesidad de sacrificar al animal y provee una forma recta hacia adelante para aislar las células tumorales mediante FACS, es posible marcar a las células tumorales con anticuerpos específicos de tumores fabricantes para facilitar su purificación , aunque la tinción de anticuerpos en el pez cebra puede requerir de optimización.

Finalmente, una vez que la incidencia del tumor de células de propagación se ha determinado para un tipo de tumor determinado, es posible utilizar estas pruebas para identificar los mecanismos que gobiernan la frecuencia de la célula. Por ejemplo, células tumorales primarias pueden ser tratados con inhibidores de la vía específica antes de limitar la dilución del trasplante, trasplantados o los peces se pueden dosificar con las drogas. Además, la genética de los tumores se pueden manipular mediante la inyección de los peces de una etapa de células con un gen de interés, de modo que los tumores primarios resultantes se sobre-expresan el gen. En estos experimentos, ningún efecto sobre la frecuencia de auto-renovación de células se observaron en los ensayos de dilución límite.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Noti enzima de restricción	New England Biolabs	R0189
Fenol: cloroformo	EMD Bioquímicos	6805-OP
KCl 5M	Sigma-Aldrich	P9541
100X Tris-EDTA	Sigma-Aldrich	T9285
Gama alta escalera del ADN	Fermentas	R0621
Singénico pez cebra		Referencias 8.6
De suero fetal bovino	Gibco	16000-036
Yoduro de propidio	Sigma-Aldrich	P4864
26G / 2 "Microjeringa	Hamilton	80366
Malla de 40μm de células colador	BD Falcon	352340