Quantifier la fréquence des tumeurs se propageant Cellules utilisant Limiter la greffe de cellules syngéniques de dilution dans Zebrafish

Résumé

Limitation des dosages de dilution transplantation de cellules sont utilisées pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules propager. Ce protocole décrit une méthode pour générer le poisson-zèbre syngéniques qui développent une leucémie marqués à la fluorescence et les détails la façon d'isoler et de transplanter ces cellules leucémiques à limiter la dilution dans la cavité péritonéale du poisson zèbre adulte.

Résumé

Cellules cancéreuses d'auto-renouvellement sont les types de cellules que dans une tumeur qui ont une capacité illimitée de favoriser la croissance tumorale, et sont donc connus que la tumeur se propageant, ou des cellules tumorales initiatrices. On pense que le ciblage de ces cellules auto-renouvellement pour la destruction va bloquer la progression tumorale et l'arrêt des rechutes, améliorant considérablement le pronostic du patient ^1. La façon la plus courante pour déterminer la fréquence de l'auto-renouvellement des cellules dans une tumeur est un test de dilution limite transplantation de cellules, dans lesquelles les cellules tumorales sont transplantés dans des animaux receveurs à des doses croissantes, la proportion d'animaux qui développent des tumeurs est utilisée, le calcul du nombre d'auto-renouvellement des cellules au sein de l'échantillon de tumeur d'origine ^{2, 3.} Idéalement, un grand nombre d'animaux seraient utilisés dans chaque expérience de dilution limite pour déterminer avec précision la fréquence des tumeurs des cellules propager. Cependant, des expériences à grande échelle impliquant des souris sont coûteuses, et la plupart des dosages de dilution limite l'utilisation seulement 10-15 souris par expérience.

Le poisson zèbre ont gagné en importance en tant que modèle de cancer, en grande partie à cause de leur facilité de manipulation génétique et de l'économie par des expériences à grande échelle qui peuvent être effectuées. En outre, les types de cancer chez le poisson zèbre modélisés ont été trouvés à l'imitent leurs ⁴ maladies homologue humain. Bien qu'il soit possible de transplanter des cellules tumorales d'un poisson à un autre en sous-létales d'irradiation des animaux destinataire, la régénération du système immunitaire après 21 jours provoque souvent une régression tumorale ^5. La création récente de poisson zèbre syngéniques a grandement facilité les études de transplantation de tumeurs ^6-8. Parce que ces animaux sont génétiquement identiques, les cellules tumorales transplantées se greffer robuste en poissons du destinataire, et la croissance tumorale peut être surveillé sur de longues périodes de temps. Syngéniques zebrafish sont idéales pour limiter la dilution dans la transplantation des essais que les cellules tumorales n'ont pas à s'adapter à la croissance dans un microenvironnement étrangers, ce qui peut sous-estimer la fréquence des cellules auto-renouvellement ^{9, 10.} En outre, une transplantation de cellules ont été réalisés avec succès en utilisant le poisson zèbre syngéniques ⁸ et plusieurs centaines d'animaux peuvent être facilement et économiquement transplanté à un moment, qui tous deux servent à fournir une estimation plus précise de l'auto-renouvellement de fréquence cellulaire.

Ici, une méthode est présentée pour la création de primaire, marqués à la fluorescence des cellules T de leucémie aiguë lymphoblastique (T-ALL) chez le poisson zèbre syngéniques, et la transplantation de ces tumeurs à limiter la dilution dans les poissons adultes pour déterminer la fréquence des cellules auto-renouvellement. Alors que la leucémie est fourni à titre d'exemple, ce protocole est adapté pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules propageant en utilisant n'importe quel modèle de cancer chez le poisson zèbre.

Protocole

1. Microinjection d'ADN des embryons de poissons zèbres

1. Linéariser rag2:: cMyc et rag2: les constructions GFP DNA ¹¹ en digérant 10 pg de chaque plasmide avec Notl à 37 ° C pendant la nuit.
2. Phénol: extrait de chloroforme et précipiter les plasmides, et remettre chacun à 20 pi H ₂ O.
3. Déterminer la concentration de l'ADN en exécutant une dilution 1:1, 1:5 et 1:10 de chaque plasmide digéré sur un gel d'agarose 1% avec 20 pi, 10 pi et d'une échelle 5uL de l'ADN de haute gamme. Ce type de quantification est généralement plus précis que d'une lecture du spectromètre.
4. Diluer l'ADN à une concentration finale de 1M KCl 60ng/μL de TE 0,5 X pour injection dans CG1-souche (ou d'autres souches syngéniques) embryons de poissons zèbres utilisant 30ng/μL rag2:: cMyc + 30ng/μL rag2:: GFP.
5. Les injections doivent être effectuées que ¹² précédemment ^{démontré, 13.} Brièvement, le poisson-zèbre mâle et femelle sont mis en place dans les chambres à l'accouplement de la nuit avant l'injection. Le jour de l'injection, l'ADN est chargé dans l'aiguille d'injection, la pression est ajustée de telle sorte que la bulle d'un diamètre 50 microns est expulsé (30pg ADN), qui est mesurée par un micromètre. Puis, les embryons sont injectés au stade d'une cellule, avec l'ADN étant injecté directement dans la cellule, et non dans le jaune. La survie de la CG1 injecté embryons et des larves est généralement faible, et seulement 5% des poissons intégrer avec succès le transgène, ainsi,> 600 embryons devraient être injectés pour garantir que certains poissons se développer une leucémie.
6. Stocker les embryons injectés à 28,5 ° C, et de supprimer les embryons morts après 24 heures. Les animaux sont ensuite transférés à de grands réservoirs à 5 jours de vie et a grandi comme décrit précédemment ^14.

2. Le dépistage de T-ALL primaires chez les larves de poisson zèbre

1. Environ 28 jours après l'injection, anesthésier le poisson-zèbre larvaires en ajoutant 200 ul d'4NG / m Tricane-S à 25 ml d'eau du système de poissons dans une boîte de Pétri.
2. Examiner les larves pour le développement de fluorescence étiquetés T-ALL en utilisant un microscope à épifluorescence à un grossissement de 20x, avec une longueur d'onde d'excitation et d'émission 485/20 530/25 filtre pour détecter la fluorescence GFP (figure 1).
3. Séparée larves tumorales positives de celles qui sont négatives. Larves négatives peuvent être examinées à un stade ultérieur, une fois les tumeurs peuvent avoir grandi, pour s'assurer que pas de T-ALL poissons positifs ont été manquées.
4. Moniteur T-ALL poissons positifs au moins une fois à la semaine en utilisant le microscope à épifluorescence pour suivre la croissance tumorale.

3. L'isolement et la purification de l'marqués à la fluorescence des cellules leucémiques primaires

1. Lorsque les cellules leucémiques GFP-positives ont dépassé> 50% de l'animal, le sacrifice du poisson en ajoutant 1 ml de 4ng/mL Tricane-S dans une boîte de Pétri contenant 9 ml d'eau du système de poisson.
2. Placer le poisson dans un plat de Pétri contenant de nouvelles 1ml 0.9x PBS avec 5% de sérum bovin fœtal à amortir les cellules. Faire macérer les poissons avec une lame de rasoir, une pipette le mélange de dissocier touffes à grandes cellules, puis passer les cellules à travers un tamis 40μm dans un tube de 50ml. Il n'est pas nécessaire de dissocier les amas de tissu dans des cellules individuelles.
3. 500μL Pipet des cellules dans un tube de polystyrène 4mL. Ajouter 1 microlitre 1mg/mL iodure de propidium (PI), qui sera l'étiquette cellules mortes. Vortex, puis maintenir les cellules sur la glace.
4. Sacrifiez un type sauvage CG1 poisson, laisser macérer et de la souche de la même manière que ci-dessus pour collecter les cellules normales, qui servent de support pour les cellules tumorales au cours transplant.Add 4mL 5% FBS dans 0.9x PBS pour le tube de 50 ml pour un total volume de 5 mL.
5. Compter les cellules normales, diluer à 3x10 ⁵ cellules / mL dans 5% de FBS en 0.9x PBS, puis 100μL/well pipette d'une plaque de 96 puits.
6. En utilisant un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS), trier GFP-positives, PI cellules tumorales négatives (figure 2A, B) dans la plaque de 96 puits contenant les cellules sanguines aux doses suivantes: 10 cellules / puits dans 48 puits, 100 cellules / puits dans 24 puits, 1000 cellules / puits dans 12 puits et 10 000 cellules / puits dans 6 puits. De plus, 10 000 cellules doivent être triés dans un puits sans cellules sanguines normales, et retestés utilisant FACS pour évaluer la pureté et la viabilité des cellules triées (figure 2C).

4. Limiter la transplantation de dilution dans le poisson-zèbre pour adultes

1. Pellet les cellules par centrifugation de la plaque de 96 puits à 2000xg pendant 10 minutes.
2. Retirer 95μL de surnageant et remettre en suspension les cellules dans le 5uL restantes.
3. Tenir un adulte (> 60 jours) syngéniques secondaires zebrafish ventrale en place, et injecter la suspension de cellules dans la cavité péritonéale, en utilisant un 26G / 2 "micro-seringue. Zebrafish n'ont pas à être anesthésiés avant la greffe. Typiquement, 45 poissons sont transplantés avec 10 cellules de leucémie, 20 sont transplantés avec 100 cellules, 7 sont transplantés avec 1.000 cellules et 5 poissons sont transplantés avec 10.000 T-toutes les cellules.

5. Analyse pour déterminer la leucémie-initier la fréquence de cellules

1. Environ 28 jours après la transplantation, examiner le poisson transplanté avec un microscope à l'aide d'un epifluoresence onde d'excitation et d'émission 485/20 530/25 filtre pour détecter la fluorescence GFP. Notez le nombre de poissons positifs par rapport au nombre total de poissons injectés.
2. Re-examiner le poisson tous les 14 jours pour un maximum de 90 jours et d'enregistrer le nombre de poissons positif. Quand un poisson tumeurs positives devenue moribonde, le sacrifice de l'animal par Tricane-S surdosage.
3. Entrée des résultats dans un tableau, comme dans la figure 3D. Charger les données dans le ELDA basé sur le Web (Extreme Analyse de dilution limite) des logiciels statistiques au http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html ^15, qui utilise la fréquence des tumeurs des animaux positifs et négatifs à chaque dose de greffe afin de déterminer la fréquence de l'auto-renouvellement des cellules leucémiques primaires au sein du T-ALL.

6. Les résultats représentatifs:

Microinjection d'ADN dans des embryons de poissons syngéniques traduit souvent par un faible taux de survie des embryons injectés, avec <60% des embryons survivent pendant 24 heures. De plus, la survie des poissons injectés syngéniques est généralement faible durant le développement larvaire, avec souvent <20% survivent pendant 28 jours. Il est donc important d'injecter un grand nombre d'embryons en vue de créer les poissons transgéniques qui développent T-ALL.

À titre d'exemple, CG1 embryons souche ont été injectés avec rag2:: cMyc + rag2:: GFP. Les transgènes co-ségrégation dans l'embryon en développement, afin que chaque cellule qui exprime la GFP sera également exprimer cMyc. Les larves ont été projetés pour le primaire T-ALL après 28 jours (figure 1). Des travaux antérieurs ont montré que 5% environ des poissons injectés auront GFP-positives cellules T dans leur thymus (figure 1), et 100% de ces poissons se développer une leucémie que les T-cellules deviennent ¹¹ transformé. Bien qu'une faible proportion de poisson zèbre peut avoir une leucémie plus avancé qui est très facile à détecter à jour 28, la plupart n'auront qu'un GFP-positives du thymus (figure 1), donc les larves doivent être examinés individuellement sous fort grossissement pour s'assurer que tous positifs poissons sont sélectionnés. GFP-positives T-ALL cellules dépassera> 50% de l'animal entre les jours de 45 à 70.

Dans l'exemple fourni, le poisson zèbre ont été sacrifiés à 65 jours de vie, et les cellules leucémiques ont été isolées et FACS triés pour limiter la transplantation de dilution. Les cellules individuelles qui ont été négatifs iodure de propidium et GFP-positives (figure 2) ont été triés dans une plaque de 96 puits. Réanalyse a été effectué sur 10 000 cellules triées afin d'évaluer la viabilité (idéalement> 95%) et la pureté (idéalement> 92%, figure 2). Transplantés T-ALLS résultent généralement avant 28 jours, mais certaines tumeurs peuvent prendre plus de 60 jours pour se développer. Dans cet exemple, au 28ème jour, les tumeurs stade précoce ont été considérées comme un domaine de la GFP de cellules positives à proximité du site d'injection (figure 3B), tandis que certains ALLS T-étaient plus progressé, ayant élargi pour remplir la cavité péritonéale (figure 3C) . Les données provenant des essais de dilution en limitant la transplantation de cellules primaires à partir de trois différents T-Alls sont présentés dans la figure 3D. Pour ces expériences, plus de 220 animaux ont été transplantés, qui peut être facilement accompli par une personne au sein de plusieurs heures. L'analyse des données en utilisant le logiciel ELDA a montré que, en moyenne, 1 à 135 T-ALL cellules ont été auto-renouvellement des cellules leucémiques se propageant (figure 3F).

Figure 1 larves de poisson zèbre injectés au stade d'une cellule avec un chiffon.::-CMyc + chiffon::-eGFP ont été testés pour la croissance de leucémie primaire 28 jours après l'injection. Poisson (*) avait GFP-positives cellules T dans le thymus, ce poisson se développera T-ALL comme les lymphocytes T se transforment au fil du temps. Cette étape est très commun au 28ème jour. Un poisson (**) avait une pointe T-ALL qui s'est propagé dans les tissus mous. Les deux autres poissons sont négatifs pour la croissance tumorale. L'image a été prise à un grossissement de 16X.

Figure 2. Marqués à la fluorescence T-ALL cellules ont été triées à partir d'animaux malades et utilisé dans le dosage de transplantation de cellules de dilution limite. Tout d'abord, un portail a été élaboré pour sélectionner des cellules individuelles (panneau supérieur gauche), puis l'iodure de propidium cellules négatives sont sélectionnés (au milieu à gauche). Enfin, une porte a été élaboré pour sélectionner uniquement les GFP-positives pour le tri des cellules leucémiques (panneau inférieur gauche). Tri des cellules doit être réanalysé pour évaluer la viabilité et la pureté avant la greffe (panneaux de droite).

Figure 3. Zebrafish ont été examinés pour la croissance de leucémie 28 jours après la transplantation. Les poissons sont soit des tumeurs négATIFS (A), ont une petite tumeur croissante au site d'injection (B), ou avoir une leucémie progressé (C). Les images ont été prises à un grossissement de 7X. Le nombre total de leucémie positif poissons par nombre total de poissons transplantés à chaque dilution est enregistré, comme dans (D). Les données sont entrées dans le programme basé sur le Web ELDA pour calculer le nombre d'auto-renouvellement des cellules de leucémie et le 95 supérieures et inférieures des intervalles de confiance% (E).

Discussion

Une des grandes forces de l'utilisation de poissons zèbres de recherche sur le cancer est qu'un grand nombre d'animaux peut être utilisé à un coût relativement faible. Ceci est particulièrement important dans la limitation des essais de dilution transplantation de cellules, où les proportions d'animaux transplantés qui développent des tumeurs au nombre total transplantés sont utilisés pour déterminer la fréquence des tumeurs initier cellule. Dans la méthode présentée ici, plus de 70 animaux receveurs de greffe sont utilisés par test, en fournissant une estimation précise du nombre de cellules de tumeur se propage. Tant le nombre d'animaux utilisés et les doses de cellules tumorales transplantées devraient être optimisés pour un modèle de cancer donné, par exemple, si les premières expériences montrent la tumeur initier les cellules sont rares, les doses peuvent être utiles greffe 100000, 50000, 10000 et 1000 cellules par transplantation.

Syngéniques souches de poisson zèbre sont utiles dans l'analyse de limiter la dilution. Cependant, ces souches ne sont pas encore couramment utilisés dans tous les laboratoires, et certains modèles de cancer zebrafish existent seulement dans les poissons allogènes. Limiter les transplantations de cellules de dilution peut être effectuée dans des souches sauvages qui ont subi l'ablation immunitaire, bien que la fréquence des cellules auto-renouvellement peut être calculé comme 10 à 100 fois plus élevée que si le poisson-zèbre syngéniques ont été utilisés ^8. Il est important de noter que des doses de cellules doivent être utilisés pour des transplantations en non-immunes appariés, les destinataires irradiés, comme certaines cellules tumorales ne survivra pas transplanter dans un microenvironnement étrangers. De plus, de nombreuses tumeurs ne commencent à régresser après 21 jours lorsque le système immunitaire de l'animal receveur récupère donc les animaux doivent être évalués pour la croissance tumorale tous les 7 jours après la greffe.

Les méthodes présentées ici sont adaptés pour une utilisation avec n'importe quel modèle de cancer du poisson zèbre, et ont jusqu'à présent été utilisées pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules initier à la fois dans des cellules T leucémie aiguë lymphoblastique ^8, et un modèle de tumeur solide, le rhabdomyosarcome ^16. Ces tumeurs ont été marqués par fluorescence par co-injection d'embryons à la fois avec un oncogène et de marqueur fluorescent; car l'ADN co-ségrégation, toute cellule exprimant l'oncogène également exprimer la protéine fluorescente ^17. Alors que la fluorescence est recommandée car elle facilite le suivi de la croissance tumorale, sans la nécessité de sacrifier l'animal et fournit un moyen straight-forward pour isoler les cellules tumorales par FACS, il est possible d'étiqueter les cellules tumorales avec des anticorps spécifiques de la tumeur décideurs pour faciliter leur purification , coloration des anticorps bien chez le poisson zèbre peut exiger d'optimisation.

Enfin, une fois l'incidence des tumeurs propageant cellules a été déterminée pour un type de tumeur donné, il est possible d'utiliser ces tests pour identifier les mécanismes qui régissent leur fréquence cellulaire. Par exemple, les cellules tumorales primaires peuvent être traités par des inhibiteurs spécifiques voie avant de limiter la dilution de greffe, ou des poissons transplantés eux-mêmes peuvent être dosés avec des médicaments. De plus, la génétique des tumeurs elles-mêmes peuvent être manipulées par l'injection des poissons stade unicellulaire avec un gène d'intérêt, alors que les tumeurs primaires résultant seront sur-expriment le gène. Dans ces expériences, aucun effet sur l'auto-renouvellement des cellules de fréquence sera observée dans les essais de dilution limite.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Le nom du réactif	Société	Nombre de catalogue
Enzyme de restriction NotI	New England Biolabs	R0189
Phénol: chloroforme	Biochimiques EMD	6805-OP
KCl 5M	Sigma-Aldrich	P9541
100X Tris-EDTA	Sigma-Aldrich	T9285
Haute Gamme échelle d'ADN	Fermentas	R0621
Syngéniques zebrafish		Références 6-8
Sérum de veau fœtal	Gibco	16000-036
L'iodure de propidium	Sigma-Aldrich	P4864
26G / 2 "Microseringue	Hamilton	80366
Tamis 40μm maille	BD Falcon	352340