الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Summary

توضح هذه المقالة تقنية لتصور الأحداث المبكرة من التطور الجنيني في الخيطية انواع معينة ايليجانس.

Abstract

ايليجانس انواع معينة وغالبا ما تستخدم نظام نموذجي في الدراسات التنموية من العمليات في وقت مبكر. الشفافية في الأجنة ، والموارد الجينية ، والسهولة النسبية للتحول هي الصفات التي تجعل C. ايليجانس نموذجا ممتازا لمرحلة التطور الجنيني المبكر. القائم على الليزر والمجهر مبائر به fluorescently المسمى تسمح للباحثين لمتابعة هياكل محددة والبروتينات الخلوية في الأجنة النامية. على سبيل المثال ، يمكن للمرء متابعة العضيات محددة ، مثل lysosomes أو الميتوكوندريا ، وذلك باستخدام الأصباغ fluorescently المسمى. يمكن أن يتم تسليم هذه الأصباغ على الجنين في وقت مبكر عن طريق microinjection في الغدد التناسلية الكبار. أيضا ، يمكن أن يتبع توطين بروتينات معينة باستخدام بروتين فلوري به. وتعرض الأمثلة التي تبين هنا استخدام صبغة الفلورسنت الليزوزومية فضلا الموسومة fluorescently البروتينات هيستون واليوبيكويتين. يتم استخدام المسمى هيستون لتصور الحمض النووي ، وبالتالي تحديد مرحلة من مراحل دورة الخلية. GFP الموسومة اليوبيكويتين يكشف عن ديناميات حويصلات ubiquitinated في الجنين في وقت مبكر. يمكن استخدامها لتحديد ما إذا اليوبيكويتين هناك colocalization بين الحويصلات ubiquitinated وlysosomes : ملاحظات lysosomes وصفت وGFP :. وتقدم تقنية لmicroinjection الصبغة الليزوزومية. وتعرض تقنيات لتوليد سلالات transgenenic في مكان آخر (1 ، 2). التصوير ، ويتم قطع أجنة من الديدان الخيطية خنثى الكبار وعلى منصات محمولة على agarose 2 ٪ تليها الوقت الفاصل بين المجهري على الليزر القياسية أو المسح المجهر متحد البؤر المجهر القرص الغزل مبائر. هذه المنهجية ينص على التصور وارتفاع القرار من مرحلة التطور الجنيني المبكر.

Protocol

1. الخيطية الثقافات

1. الحصول على جيم المناسبة سلالة ايليجانس انواع معينة من مركز علم الوراثة ألبوم (CGC) ، أو من زميل.
2. تنمو الديدان الخيطية على لوحات أجار NGM المصنف مع العشب an البكتيرية OP50 (3). لتحليل نمو سلالات GFP عند 25 درجة مئوية ويوصى.
3. قبل يوم من التجربة المجهري الخاص ، واختيار ما لا يقل عن 40 L4 اليرقات المصنفة على لوحات لوحات والمكان عند 25 درجة مئوية خلال الليل. وسوف تكون هذه الديدان الشباب للتجربة.

2. الحقن

إذا كان من المستحسن أن يتم عرض مثل هياكل lysosomes أو الميتوكوندريا ، يمكن حقن صبغة الفلورسنت مع الكبار قبل التصور.

1. إعداد منصات حقن agarose المجفف. (ويمكن أن يتم هذا واحد لعدة أيام قبل)
   1. إعداد المنصهر agarose 2 ٪ في الماء. مع ماصة باستور وضع قطرات في الصعود إلى 2 ملم 22X54 ساترة. مكان آخر ساترة عبر الحكيم على رأس قطرة. من أجل تحقيق سمك السليم ، اضغط على أعلى ساترة قطرها حتى لوحة حوالي 1.5 سم. اسمحوا الجلوس لمدة 5-10 دقائق.
   2. إزالة ساترة العلوي. يذوى لوحة agarose بوضعه في الفرن 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة أو السماح للجلوس على الفوق بين عشية وضحاها.
2. إعداد Mitotracker أو حل Lysotracker.
   1. تمييع وكيل الفلورية في مخزن البيض. نستخدم عادة التخفيف من 1:10 Mitotracker أو Lysotracker.
   2. يتم حقن الإبرة من الزجاج OD 1.2 الشعرية. سحب إبرة الحقن باستخدام مجتذب الإبرة.
   3. استخدام الماصة Pastuer سحبت لملء الإبرة مرة أخرى مع الصبغة المخفف.
   4. إبرة مكان في الغرفة ، وعلى ضوء خالية حتى استخدام مرطب.
3. قبل حقن : إعداد المجهر والإبرة.
   1. إبرة حقن جبل على جهاز الحقن. جهاز لدينا هو micromanipulator Narishige المباشرة التي شنت حملة على خشبة المسرح من TE200 نيكون المجهر المقلوب مجهزة قدرة التصوير مدينة دبي للإنترنت.
   2. توصيل أنبوب الإبرة إلى 1.2 ملم معرف متصلة منظم الضغط. ويمكن استخدام إما الهواء المضغوط أو النيتروجين كمصدر للضغوط الخارجية. ضبط منظم إلى 20-25 رطل.
   3. 2 وضع قطرات من الزيت المعدني الثقيل (النفط Parafin) على لوحة الحقن.
   4. مكان اللوحة على حقن المجهر وخفض الإبرة في النفط. الاختيار لجعل تدفق السوائل بحرية تأكد من الإبرة عندما يتم تطبيق الضغط. الضغط الحقن ومراعاة ما إذا كان السائل يتدفق من الإبرة. إن لم يكن ، وسوف تحتاج لكسر بلطف نهاية الإبرة. ويمكن تقسيم الإبرة من قبل القيادة برفق صوب قطعة صغيرة من كسر ساترة وضعت على منصة الحقن. بعد الإبرة يتدفق ، والانتقال إلى الخطوة التالية.
4. الحقن.
   1. حوالي 1 ساعة قبل عرض الأجنة ، ونقل الشاب البالغ الديدان في انخفاض اسعار النفط على منصة الحقن. تنفيذ هذا النقل باستخدام مجهر تشريح. استخدام الدودة السلكية اختيار البلاتين مع طرف وأشار لنقل الديدان.
   2. ترتيب 3-10 الديدان بحيث أنهم يكذبون مباشرة على لوحة. للحقن ، فمن أسهل إذا تصطف الديدان حتى موازية لبعضها البعض ، وأقل قليلا من واحد طول الدودة إربا. بمجرد أن الديدان الموجودة على لوحة الحقن من المهم العمل بسرعة واستكمال عملية الحقن قبل الديدان يهلك من الجفاف.
   3. ضع ساترة مع الديدان على خشبة المسرح مجهر المجهر الحقن. التركيز في الجزء المركزي (السيساء) من الأنبوب القاصي الغدد التناسلية. ثم استخدم لنقل micromanipulator غيض من الإبرة إلى الطائرة الاتصال نفسه. التحرك أفقيا حتى المرحلة التي يتم ثقب الدودة بواسطة الإبرة. مرة واحدة في رأس الإبرة هو داخل السيساء ، والضغط على الغدد التناسلية ، والسماح لملء مع خليط صباغة. ضخ ذراعيه لجميع الغدد التناسلية الديدان على منصة الحقن.
   4. بعد الحقن ، واستخدام الماصة باستور سحبت لتسليم حوالي 0.5 مل من مخزن للبيض الديدان. هذا وسوف تبقي منهم من يموتون من الجفاف والسماح لهم للتعافي من إجراء الحقن.
   5. السماح لاسترداد الديدان لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة في الغرفة ، وعلى ضوء خالية من ترطيب.

3. Agarose منصة للعرض الأجنة

1. إعداد المنصهر agarose 2 ٪ في مخزن البيض.
2. مع الماصة باستور ، وطرح 3 قطرات من agarose المنصهر على شريحة المجهر نظيفة.
3. الشريحة مكان بين اثنين من الشرائح الأخرى التي لديها طبقة واحدة من العلامات الشريط تغطيتها. هذه بمثابة الفواصل التي من شأنها ضمان بأن ما تتمتعون به agarose سادة هو سمك الصحيحة.
4. المركز الثاني شريحة المجهر نظيفة أسفل عموديا على قطرات agarose. اضغط لأسفل حتى الشريحة العليا تقع على الشريط من الشرائح الدليل.
5. قبل قليل كنت على استعداد لشن الأجنة لمراقبة وإزالة الشريحة العليا.

معشوقة = "jove_title"> 4. تصاعد الأجنة للعرض

1. إذا لم يتم حقن الديدان ، اتبع الخطوتين التاليتين. تخطي خلاف عليها.
   1. اختيار الديدان الشباب البالغين من لوحة التي تم إعدادها في اليوم السابق. يجب أن تكون قادرا على رؤية الجنين داخل البالغين الشبان.
   2. اختيار 50-20 الديدان على لوحة NGM غير المصنف. السماح للديدان إلى الزحف نحو غير المصنف على لوحة لبضع دقائق حتى أن الديدان سوف تفقد معظم البكتيريا التي عالق لهم.
2. الحصول على أجنة صغار البالغين من الديدان
   1. مكان هبوط 50-20 ميكرولتر من الاحتياطي البيض في منتصف ساترة زجاج 18 مم ² (سمك 1.5 ساترة هو الأفضل).
   2. نقل الديدان من لوحة غير المصنف أو وسادة الحقن في قطرة من الاحتياطي البيض.
   3. قطع الديدان مفتوحة مع إبرة تحت الجلد قياس 26. قطع مفتوحة الدودة قرب الفرج. سترى الأجنة تسرب من الدودة.
3. جبل على شريحة المجهر
   1. عكس الشريحة المجهر الذي أعد مع لوحة agarose والسفلى وضعها على ساترة مع الأجنة.
   2. إذا كان المطلوب تمديد الفترة الزمنية ، واستخدام الفازلين لختم حواف ساترة لمنع أصاب.

5. المجهري

1. العثور على الأجنة المناسبة.
   1. الشريحة مكان على الساحة المجهر. تفحص مع عدسة 10X للعثور على الأجنة.
   2. العثور على الأجنة مرحلة مبكرة ، والبحث عن الأجنة التي هي في طور استكمال الانقسام الاختزالي الأمهات. ويمكن تمييز الأجنة الانتصافي من أجنة في وقت لاحق لأنهم لم يخضعوا لتقصير. (الأجنة بعد الانتهاء الانقسام الاختزالي ، يمكنك ان ترى وجود فجوة كبيرة بين غشاء الخلية وقشرة البيضة في نهاية الأمامي).
   3. ذات مرة كنت قد رصدوا نظموا الجنين بشكل مناسب ، والانتقال إلى عدسة التكبير العالي لتسجيل مرحلة التطور الجنيني.
2. التصوير
   1. في هذا المثال ، تخيل أننا الأجنة التي تعبر عن mCherry : H2B وGFP : UB الموسومة البروتينات. نحن نستخدم LSM700 زايس المسح بواسطة أشعة الليزر التقليدية المجهر.
   2. يتم جمع الصور باستخدام عدسة 1.4NA 63X. تستخدم أشعة الليزر 488 و 555 مع قوة الليزر وكسب الحد الأدنى من الحد الأقصى. يتم جمع كل ثانية من الالف الى الياء المكدس 10-15. اعتمادا على مدى photobleaching ، يتم جمع النقاط الزمنية 30-60. وانهار صور المكدس Z إلى صورة إسقاط الحد الأقصى للفيديو الوقت الفاصل النهائي.

6. ممثل النتائج :

الشكل 1. التسميد على الانقسام الميتوزي الأولى في C. ايليجانس.

الشكل 2. Microinjection الداخلي.

تكميلية الفيديو 1 التوقيت الفاصل الفيديو GFP :. اليوبيكويتين الأزرق زائد Lysotracker في جنين الانتصافي انقر هنا لعرض الفيديو.

Discussion

بعد الاندماج مع الحيوانات المنوية ، واقحة يخضع لسلسلة من الفعاليات الحيوية. هذه الأحداث تحويل من خلية البويضة ثابتة نسبيا في الجنين النامي بسرعة. في كثير من الكائنات ، إعادة ترتيب هيولي حاسمة لتحديد قطبية الجنينية وتنشيط البويضة. وجيم ايليجانس الجنين يوفر فرصة ممتازة لمراقبة هذه الأحداث في وقت مبكر من تنشيط البويضة وتكوين الجنين. الجنين شفافة وتحدث أحداث التنموية في وقت مبكر نسبيا بسرعة بعد الإخصاب. جيم وقد ولدت كثير من الباحثين ايليجانس السلالات المعدلة وراثيا مفيدة تعبر عن fluorescently البروتينات المسماة العاملة في مجال التنمية في وقت مبكر. باستخدام هذه السلالات مع رني المسوخ أو نظاما قويا للتشريح المسارات الجزيئية التي تكمن وراء تطور الكائن متعددة الخلايا (5 ، 6 ، 7 ، 8). هذا المقال يعرض الفيديو نهجا عمليا لاستخدام هذه الأدوات والتقنيات اللازمة لتسجيل الأحداث خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر في C. ايليجانس.

وجيم ناضجة تم القبض ايليجانس البويضة في الطور الأول من الانقسام المنصف وأنا المخصبة في spermatheca للخنثى الكبار. بعد الإخصاب ، البويضة العائدات خلال الفترة المتبقية من الانقسام الاختزالي الأول والثاني. ويمكن ملاحظة هذه المراحل باستخدام H2B هيستون fluorescently المسمى (5). أثناء الانتهاء من الانقسام الاختزالي الأمهات ، والحمض النووي الحيوانات المنوية لا تزال مكثف (انظر الشكل 1). بعد الانتهاء من الانقسام المنصف ، والحمض النووي الأم والأب ويصبح decondensed شكل pronuclei اثنين. في طليعة النواة الأم بترحيل نحو طليعة النواة الأب وينضمون معا بالقرب من مركز للجنين. الانقسام بسرعة بعد الاجتماع تستتبعه pronuclear. كل هذه الأحداث تحدث في أقل من ساعة. وبالتالي ، يمكن أن يكون الوقت الفاصل بين المجهري من هذه السلسلة من الأحداث إنجازه بسهولة. تنفيذ هذا الاسلوب يتطلب منشأة معينة في زراعة الخيطية فضلا عن المهارات الأساسية في الفحص المجهري بالإضافة إلى الوصول إلى مبائر المجهر.

المثال المعروض هنا يستخدم لجيم المعدلة وراثيا ايليجانس السلالة التي تعبر عن اثنين من البروتينات الفلورية ، GFP : اليوبيكويتين وmCherry : H2B. ويستخدم الليزر مبائر المسح المجهر لمراقبة توطين دينامية هذه البروتينات اثنين. بالإضافة إلى ذلك ، أن نظهر أنه يمكن استخدام حقن Lysotracker fluorescently المسمى لمتابعة مصير lysosomes في الجنين بعد الإخصاب. ويمكن أيضا حقن تعقب المسمى أن يؤديها لتركيزات الكالسيوم التصور الميتوكوندريا أو المحلية (9). من الناحية النظرية ، يمكن أن تستخدم بروتوكول الحقن لعرض أي نوع من جزيء fluorescently المسمى في الجنين. قد تتضمن هذه الجزيئات الصغيرة المسماة ، والبروتينات ، والدهون ، وما إلى ذلك وفي بعض الحالات ، قد لا يكون من الضروري ضخ فعلا بتتبع الديدان وصفت بأنها سوف يسهل امتصاص بعض الصبغات مثل mitotracker (10). ومع ذلك ، حاولنا كل من تمرغ وحقن lysotracker وجدت نتائج أفضل بكثير مع حقن للأجنة في التصور.

التقنية اعتبارات :

التحديات التقنية التي قدمت لهذا الإجراء تشمل تقنية microinjection فضلا عن صعوبة التصوير في الأجنة في وقت مبكر جدا. فيما يتعلق microinjections ، سمك لوحة حقن agarose هو أمر حاسم لنجاح الحقن. إذا لوحة سميكا جدا ، فإن الديدان dessicate ويموت بسرعة. إذا لوحة رقيقة جدا ، فإن الديدان لا عصا الى منصة أثناء عملية الحقن.

يمكن للأجنة مبكرة تكون حساسة للظروف البيئية مثل درجة الحرارة والظروف العازلة. وينبغي الشروع في الأجنة البرية decondensation نوع من الحيوانات المنوية والحمض النووي pronuclear الهجرة في غضون دقيقة أو نحو ذلك من استكمال الانقسام الاختزالي الثاني (4). في غضون 20 دقيقة ، وينبغي أن تبدأ أول الحرائك الخلوية. إذا تعرضت الأجنة ليزر كثافة عالية جدا أو الساخنة أو يتم سحقها خلال تصاعد ، قد يتم تعطيل هذه العملية. ومثل هذه الأجنة اعتقال التنمية. إذا حدث هذا ، ينبغي تكرار هذه التجربة مع انخفاض قوة الليزر أو لوحة agarose سمكا.

جيم ايليجانس الأجنة لا تفرز قذيفة من البيض حتى بعد فترة قصيرة من الإخصاب. خلال فترة زمنية قصيرة بين التسميد وإفراز من قشرة البيضة والأجنة ليست قابلة للحياة خارج للأم (11). تجنبت بعض المعامل هذا التحدي من خلال تصوير الأجنة في الرحم (5 ، 12). التصوير في الرحم يوفر مزايا معينة مثل القدرة على التقاط الأحداث التي تحدث أثناء أو بعد مرور الإخصاب. ومع ذلك ، هذا الأسلوب يتطلب استخدام نظام الفحص المجهري الذي يسمح لتصوير الأنسجة العميقة. هي مناسبة خاصة مثل أنظمة الفوتون اثنين أو متعدد الفوتون ، لهذا (13 ، 14). عند استخدام الليزر التقليدية أو مسح القرص مبائر الغزل المجهر ، ويتم الحصول على أفضل الصور التي هكتار من أجنةلقد تم قصها من الدودة كما هو موضح هنا.

التصوير اعتبارات النظام :

نوع نظام التصوير المستخدمة مبائر يتوقف احتياجات المستخدمين. عموما ، ينصح الليزر أنظمة المسح الضوئي إذا كان أحد يرغب في الحصول على صور ذات أعلى دقة ممكنة. من ناحية أخرى ، هي أكثر ملاءمة نظم القرص الغزل لعمليات التصوير وديناميكية للغاية الحصول على الصور سريعا نسبيا وانخفاض photobleaching / الضيائية.

سوف المعلمات التصوير محددة تختلف تبعا لتصميم التجارب ونظام التصوير مبائر العاملين. في مجال التصوير متعدد الأبعاد ، ويحتاج المرء للنظر في عدد من القنوات ، والطائرات التنسيق ، والوقت يجري جمع نقاط. يرجع ذلك إلى الحد من الآثار photobleaching والضيائية ، يمكن الحصول على عدد محدود من الصور في أي تجربة معينة. وبالتالي ، إذا اخترت لزيادة عدد القنوات التي سيتم شراؤها ، وسوف تحتاج على الأرجح إلى خفض عدد طائرات التنسيق و / أو نقاط الوقت والعكس بالعكس. وسوف يتأثر إجمالي عدد الصور التي يمكن الحصول عليها من شدة fluorophore التي يجري تصويرها ، وكذلك حساسية المجهر مبائر المستخدمة. سوف fluorophores أكثر كثافة وأكثر حساسية تتطلب الصكوك أقصر الأوقات التعرض وبالتالي تنتج أقل photobleaching والضيائية.

وهناك عدد كبير أو نظم التصوير المتوفرة. وسوف نعطي تفاصيل عن الأنظمة التي تم استخدامها في المختبرات الخاصة بنا. لأجنة دودة بواسطة التصوير المجهري القرص مبائر الغزل ، ونحن استخدام المجهر المقلوب TE2000U نيكون مجهزة 60X/1.4 NA خطة موضوعية آبو. توصيل وحدة المجهر لCSU10 يوكوجاوا القرص الغزل وهاماماتسو C9100 - 13 EM كاميرا CCD ، والبحوث التطبيقية الطيفي LMM5 حدة نمطية دمج ليزر يحتوي على أربعة أجهزة الليزر في الحالة الصلبة مع الانتاج بنحو 405 ، 491 ، 561 و 655 نانومتر. باستخدام هذا النظام يمكن أن نستولي على واحدة أو قناتين ، 6-12 طائرات التنسيق ، و25-50 timepoints (في فترات 30-60 الثانية). زمن التعرض نموذجية من 100 إلى 200 ميلي ثانية.

لأجنة التصوير مع ليزر متحد البؤر المجهر ، نستخدم زايس LSM700 مجهزة 2 وأربع قنوات ليزر الحالة الصلبة (405 ، 488 ، 555 ، 635 نانومتر و). ويرد هذا النظام إلى المراقب زايس مجهر مقلوب محوري مع خطة آبو الهدف 63X/1.4NA تستخدم لتصوير الجنين. يستخدم النظام برنامج زايس ZEN لاقتناء الصور التي تقدم أيضا محدودة ومعالجة الصور وتحليلها. عند التصوير مع اثنين fluorochromes ، ونحن نجتمع عادة طائرات التنسيق 1-5 (~ 0.5 ميكرومتر وبصرف النظر) وجمع كومة Z كل 15 ثانية. واصلت مجموعة كبيرة حتى photobleaching حدث. لإنشاء النهائي الوقت الفاصل الفيديو ، يتم دمج الصور المكدس Z باستخدام أداة الإسقاط القصوى في برنامج ZEN. يتم تصديرها من برنامج الفيديو كملفات افي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تركيب
البيض العازلة			5mM Hepes الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 110mM كلوريد الصوديوم ، 4mM بوكل ، المغنيسيوم خلات 5mm ، و CaCl 5mM 2
Mitotracker	Invitrogen	M - 7512
Lysotracker	Invitrogen	L - 7525
الماصة حقن شعرية	جهاز هارفارد ، كينت ، المملكة المتحدة	GC120F - 10
إبرة بولير	Kopf	نموذج 700C
جهاز Microinjector	Tritech بحوث	MINJ - 1 المنظم microinjection