الفئران عقدة اللمفاوية السطحية جراحة

Mélissa Mathieu; Nathalie Labrecque

doi:10.3791/3444

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

لمتابعة تطور استجابة مناعية أكثر من مرة داخل الماوس نفسه، ويمكن إزالة الغدد الليمفاوية بشكل متتابع عن طريق الجراحة. هنا، نحن تصف كيف يمكن تنفيذ هذه التقنية.

Abstract

في مجال علم المناعة، لفهم تطور استجابة مناعية ضد لقاح لعدوى أو ورم، ويتبع في كثير من الأحيان استجابة مع مرور الوقت. وبالمثل، فإن دراسة التوازن لمفاوية يتطلب بطبيعة الحال التجارب المرة. تنفيذ هذه الدراسات في الماوس نفسه مثالية للحد من التقلبات التجريبية، فضلا عن عدد من الفئران المستخدمة. سحب الدم يسمح أداء التجارب مسار الزمن، لكنه يعطي فقط معلومات حول تعميم الخلايا اللمفية، ويقدم لعدد محدود من الخلايا ^1-4. منذ الخلايا الليمفاوية من خلال تعميم الجسد والمقيمين في الغدد الليمفاوية لها خصائص مختلفة، من المهم أن تدرس كلا الموقعين. إزالة متتابعة من الغدد الليمفاوية عن طريق الجراحة يوفر فرصة فريدة لمتابعة استجابة مناعية أو توسيع الخلية المناعية في الماوس نفسه مع مرور الوقت. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب ينتج بين الخلايا ⁶ 1-2x10 في العقدة الليمفاوية التي هي كافية لPErform التوصيف المظهري و / أو فحوصات وظيفية. وقد متتابعة لعملية جراحية العقدة الليمفاوية أو الغدد الليمفاوية استخدمت بنجاح من قبلنا وغيرها من ^5-11. هنا، نحن تصف كيف يمكن إزالة العقد اللمفية العضدية، والاربية من خلال جعل شق صغير في الجلد من فأر anesthetised. منذ العملية الجراحية هو سطحي والقيام بسرعة، والماوس للشفاء بسرعة كبيرة، ويشفى تماما وليس تجربة الألم المفرط. كل يوم الثاني على التوالي، فمن الممكن لجني الغدد الليمفاوية واحد أو اثنين مما يسمح للتجارب دوام. هذا الأسلوب هو مناسب وبالتالي إلى دراسة خصائص العقدة الليمفاوية، الخلايا الليمفاوية المقيمين على مر الزمن. هذا النهج هو مناسبة لتصاميم تجريبية مختلفة، ونعتقد أن العديد من المختبرات ستستفيد من تنفيذ عمليات جراحية متتابعة العقدة الليمفاوية.

Protocol

1. إعداد قبل الجراحة

عولجت فئران وفقا لمبادئ توجيهية المجلس الكندي للرعاية الحيوان.

Anesthetise الفئران عن طريق الحقن من الكيتامين / زيلازين (150/300 ملغ / كلغ، والملكية الفكرية) أو عن طريق استنشاق isoflurane (2٪، والأكسجين 1L). إذا كانت متوفرة، يجب استخدام isoflurane لأنها تسمح لتحسين السيطرة على الوقت التخدير وعمق. أيضا، ويدير الأكسجين في نفس الوقت الذي تدعم الوظائف الفسيولوجية للحيوان. وعلاوة على ذلك، يتم التخلص مباشرة isoflurane بواسطة الرئتين، وبالتالي لا يتطلب عملية التمثيل الغذائي كبدي أو كلوي.
حقن البوبرينورفين (0،05 حتي 0،1 مغ / كغ، SC) أو مسكن آخر.
تطبيق مرهم للعين فأر قبل الجراحة لتجنب جفاف العين (إذا تم استخدام isoflurane).
تحقق من أن الفأر هو نائم بواسطة معسر مخلب والمتداول ذيله. إذا الماوس لا يتفاعل، المضي قدما في عملية جراحية.

2. في جراحة

الطبقة = "jove_content"> ومن الممكن إزالة 4 من العقد اللمفاوية السطحية (LN) عن طريق الجراحة: في الاربية (2) والعضدية 2. عزلة LN أسهل في الفئران العجاف الشباب (6-8 أسابيع) منذ وجود الأنسجة الدهنية في الفئران الأكبر سنا يمكن أن تتداخل مع العزلة LN. ومع ذلك، يتم التغلب على هذا القيد مع الممارسة المتكررة. لراحة الفئران، ونحن حصاد بحد أقصى 2 LNS في وقت واحد، وعندما نقوم الوقت طبعا التجارب، ونحن حصاد LNS كل يوم الثاني على التوالي. أيضا، للوقاية من العدوى، يمكن إعطاء المضادات الحيوية لفأر، ولكن لم نفعل ذلك والجروح وشفاء ما يرام. يحتاج المرء أن يكون على علم بأن اعتمادا على التصميم التجريبي، واستخدام المضادات الحيوية يمكن أن تؤثر في النتيجة لاحظ (على سبيل المثال إذا تم قياس استجابة لنوع من البكتيريا). لاحظ أن يتم تعقيم كل الأدوات بعد كل استخدام، وجرى الابقاء على ظروف معقمة طوال الإجراءات.

وضع الماوس على جانبها.
توطين في المنطقة حيث سيتم إجراء incisioن، اعتمادا على LN تريد الحصاد. (الشكل 1).
تطبق الكلورهيكسيدين، أو مطهر آخر، إلى تلك المنطقة.
جعل شق صغير مع مقص حاد (حوالي 5 ملم) إما على الجزء الخلفي من الرجل الاماميه أو فوق مخلب هند بالقرب من البطن (الشكل 1).
إزالة الشعر فضفاض كنت قد قطع مع الملقط. إذا كنت تفضل ذلك، قد حلق الماوس قبل إجراء شق. ومع ذلك، فإنه يطيل الداخلي ونجد أنه ليس من الضروري منذ ذلك الحين، كما هو موضح هنا، فإنه لا يحسن الشفاء أو نقصان العدوى، والتي هي نادرة جدا على حد سواء.
تمتد شق مع 2 ملقط من أجل رؤية LN. قد شق تصل الى 10 ملم. ويظهر LN رمادي أو أغمق من الدهون المحيطة بها.
قرصة فآسيا (الغشاء الرقيق الذي يغطي الدهون والأنسجة) على رأس LN مع واحد ملقط وسحب خفيفة من دون كسر الأنسجة المحيطة.
ضع ملقط 2 إلى أقصى حد ممكن underneath في LN. مع ملقط الأولى، كسر اللفافة وإزالة LN. إذا كنت قد نجحت في حصد LN، وينبغي أن وصمة عار من الدم تظهر في الموقع حيث كانت تقع في السابق LN. نلاحظ أن المصارف LN في حل متساوي التوتر. هذا اختبار بسيط يسمح لك للتحقق من صحة التي تم استخراجها 1 LN والأنسجة وليس الدهون.
تحقق من عدم وجود الشعر في الجرح.
إغلاق شق طريق الالتزام الأجزاء 2 من الجلد معا (داخل البشرة)، وتدبيس لهم مقطع. نستخدم بعض كليب ميشال مع ملقط تطبيق. تثبيت واحد أو 2 لقطات اعتمادا على حجم من شق. في معظم الأحيان، لقطات تسقط عندما النسيج يشفي.

3. بعد العملية الجراحية العناية

إضافة بعض المواد الغذائية الرطبة في الجزء السفلي من القفص وبالتالي فإن الفئران يمكن أن تغذي بسهولة بعد الجراحة.
حوالي 6 إلى 8 ساعات بعد الجراحة، والتحقق من الفئران للتأكد من أنها لا تواجه الألم. مراقبة بعناية سلوكهم (الموقف، مشية، فيteraction مع متجانس ومظهر من الفراء). إذا كان المظهر العام للفئران والفقراء، وإدارة جرعة ثانية من البوبرينورفين. في اليوم التالي يجب أن الفئران استعادة سلوكهم الطبيعي وإلا الاستمرار في إدارة البوبرينورفين. وينبغي أن الفئران لم تصل إلى النهاية التي سبق تحديدها وقبولها من قبل مجلس رعاية الحيوان الخاصة بك. قد ترغب في الحصول على المشورة والمساعدة من جهاز فني رعاية الحيوان المربى اليابس.

4. العقدة اللمفية المناولة

في المختبر، للحصول على تعليق خلية واحدة، وفصل LN وفقا للإجراءات المعتادة. نضغط LN ضد الشرائح متجمد والحصول بصورة روتينية 1-2 × 10 ⁶ خلية لكل LN. بدلا من ذلك، ونحن نستعد للLN لاستخراج الحمض النووي الريبي.
وصمة عار على الخلايا وفقا للبروتوكول الخاص المعتاد. يجب عليك الحصول المتوقع ملامح الخلوي LN تدفق.

5. ممثل النتائج

مثال ص مبعثر إلى الأمام والجانبويظهر الكثير من أجل LNS تحصد من الماوس تخدير عن طريق الجراحة أو من الماوس ضحى (الشكل 2). في لمحة والنسب المئوية للخلايا اللمفاوية في بوابة الحية هي نفسها مما يدل على أن LN جراحة هو أسلوب ملائم للخلايا الحصاد.

figure-protocol-5821
الشكل 1. الأربي والعضدية توطين LN في الماوس. يقع أ LN الأربية فقط فوق مخلب هند، قليلا نحو البطن. ب. يقع LN العضدية وراء الرجل الاماميه.

figure-protocol-6250
الرقم التدفق الخلوي 2. الملف من الخلايا الليمفاوية التي تم الحصول عليها بعد عملية جراحية LN. وتظهر ملامح مبعثر إلى الأمام والجانب لLNS تحصد من anesthetized الماوس عن طريق الجراحة (A) أو من الماوس ضحى (B). كانت تحصد LNS، فصلها وتحليلها على تدفق عداد الكريات. ويبين النسب المئوية للخلايا اللمفاوية في بوابة الحي.

Discussion

وقد وصفت نحن بروتوكولا للجراحة LN التي يمكن أن تنطبق على كثير من النظم التجريبية. وعلى الرغم من المفيد جدا لمتابعة الاستجابات المناعية أو المناعي توازن الخلية، هذه التقنية لديها عدد قليل من القيود. أولا، يمكن أن يحصد سوى أربعة LNS. ثانيا، يجب أن يكون رد الفعل المناعي در?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر سيلفي ليسيج وجميع أفراد مختبر لقراءة نقدية للبروتوكول. وأيد هذا العمل من خلال منحة (MOP-77545) من المعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR). ويدعم ناتالي Labrecque بواسطة منحة دراسية كبار FRSQ وميليسا ماتيو تلقى الكسندر غراهام بيل NSERC منحة دراسات عليا كندا.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
غريف الجميلة الملقط بريميوم نمط	هارفارد جهاز	52-2144	منحني بقوة، 10 سم (4 بوصة)، و 0.8 ملم معلومات سرية
ميشال كليب تطبيق وإزالة الملقط	هارفارد جهاز	52-3779	12.5 سم (5 بوصة)
ميشال كليب 100	هارفارد جهاز	52-3746	7،5-1،75 مم
Temgesic (البوبرينورفين هيدروكلوريد)	شيرينغ بلاو
Vetalar (هيدروكلوريد الكيتامين)	Boniche الحيوان للرعاية الصحية		الدين: 01989529
Rompun (زيلازين)	باير		الدين: 02169592
Isoflurane	ABBOTT		الدين: 02032384
Hypotears العين مرهم	نوفارتيس Ophtalmics		الدين: 02133288
Baxedin (Clorhexidine جلوكونات 2٪ في ايزوبروبيل 70٪)	أوميغا	L0000017	الدين: 02251477

References

Zehn, D., Lee, S. Y., Bevan, M. J. Complete but curtailed T-cell response to very low-affinity antigen. Nature. 458, 211-214 (2009).
Vezys, V. Memory CD8 T-cell compartment grows in size with immunological experience. Nature. 457, 196-199 (2009).
Zhou, X. Differentiation and persistence of memory CD8(+) T cells depend on T cell factor 1. Immunity. 33, 229-240 (2010).
Wirth, T. C., Badovinac, V. P., Zhao, L., Dailey, M. O., Harty, J. T. Differentiation of central memory CD8 T cells is independent of CD62L-mediated trafficking to lymph nodes. J. Immunol. 182, 6195-6206 (2009).
Rooke, R., Waltzinger, C., Benoist, C., Mathis, D. Targeted complementation of MHC class II deficiency by intrathymic delivery of recombinant adenoviruses. Immunity. 7, 123-134 (1997).
Witherden, D. Tetracycline-controllable selection of CD4(+) T cells: half-life and survival signals in the absence of major histocompatibility complex class II molecules. J. Exp. Med. 191, 355-364 (2000).
Labrecque, N. How much TCR does a T cell need. Immunity. 15, 71-82 (2001).
Leignadier, J., Labrecque, N. Epitope density influences CD8+ memory T cell differentiation. PLoS One. 5, e13740 (2010).
Leignadier, J., Hardy, M. P., Cloutier, M., Rooney, J., Labrecque, N. Memory T-lymphocyte survival does not require T-cell receptor expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20440-20445 (2008).
Obst, R., van Santen, H. M., Mathis, D., Benoist, C. Antigen persistence is required throughout the expansion phase of a CD4(+) T cell response. J. Exp. Med. 201, 1555-1565 (2005).
Bassett, J. D. CD8+ T-cell expansion and maintenance after recombinant adenovirus immunization rely upon cooperation between hematopoietic and nonhematopoietic antigen-presenting cells. Blood. 117, 1146-1155 (2011).
Lacombe, M. H., Hardy, M. P., Rooney, J., Labrecque, N. IL-7 receptor expression levels do not identify CD8+ memory T lymphocyte precursors following peptide immunization. J. Immunol. 175, 4400-4407 (2005).
Leignadier, J., Rooney, J., Daudelin, J. F., Labrecque, N. Lowering TCR expression on naive CD8+ T cells does not affect memory T-cell differentiation. Immunol. Cell. Biol. 89, 322-325 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: