小鼠浅表淋巴结手术

摘要

遵循多时间内相同的鼠标免疫反应的进展，淋巴结可以依次通过手术切除。在这里，我们描述了这种技术可以如何执行。

摘要

在免疫学领域，了解进展对疫苗，感染或肿瘤的免疫反应，反应之后往往随着时间的推移。同样，淋巴细胞稳态的研究需要时间课程实验。这些研究是在相同的鼠标理想，以减少实验的变异，以及使用的老鼠数量。抽血时间课程实验允许的性能，但它只能提供约外周血淋巴细胞的信息，并提供数量有限的细胞^1-4。由于通过人体循环和居住在淋巴结中的淋巴细胞有不同的特性，重要的是要检查这两个地方。淋巴结顺序切除手术提供了一个独特的机会，后续的免疫反应或免疫细胞膨胀，随着时间的推移相同的鼠标。此外，这种技术的产生，这是足够的PE 1-2X10 ^6个淋巴结细胞之间rform表型特征和/或功能分析。顺序淋巴结手术或淋巴结清扫已成功地应用于我们和其他国家^5-11。在这里，我们描述如何可以通过一个小切口，在皮肤一个anesthetised鼠标删除臂丛和腹股沟淋巴结肿大。由于手术是肤浅的，并迅速完​​成，鼠标恢复速度非常快，愈合好，不会遇到过多的疼痛。每隔一天，有可能收获一个或两个淋巴结允许时间课程实验。因此，该技术是适合学习节点居住淋巴细胞淋巴结的特点，随着时间的推移。这种方法适用于各种实验设计，我们相信，许多实验室将受益于执行顺序淋巴结手术。

研究方案

1。手术前的准备工作

根据加拿大动物护理准则理事会处理小鼠。

1. anesthetise小鼠注射氯胺酮/甲苯​​噻嗪（150/300毫克/千克，IP）或异​​氟醚吸入（2％，1L氧气）。如果可以，异氟醚应该使用，因为它允许为更好地控制麻醉时间和深度。此外，氧管理的同时，支持动物的生理功能。此外，异氟醚直接消除肺部，因此并不需要肝，肾代谢。
2. 注入丁丙诺啡（0.05 - 0.1毫克/千克，SC）或另一种止​​痛药。
3. 适用于鼠标的眼睛上的药膏，手术前，以避免眼睛干涩（如果使用异氟醚）。
4. 确认鼠标是睡着了捏它的爪子，滚它的尾巴。如果鼠标没有反应，进行手术。

2。手术

很可能浅表淋巴结（LN），通过手术移除4：2腹股沟和2臂丛。 LN的隔离更容易在年轻瘦老鼠，因为在老年小鼠的脂肪组织的存在（6-8周）可与LN隔离干扰。然而，这一限制被克服，反复练习。为的小鼠舒适，我们收获一次最多2淋巴结，当我们执行时间课程实验，我们收获LNS每隔一天。此外，为防止感染，抗生素可以给鼠标，但我们不这样做，伤口愈合得很好。一个需要注意，根据实验设计，使用抗生素，可能会影响观察的结果（例如，如果细菌的反应测量）。请注意，所有仪器每次使用后消毒和无菌条件下保持整个程序。

1. 鼠标放在其副作用。
2. 本地化的地区，在那里你会执行incisioN，这取决于你想收获的法律公告。 （ 图1）。
3. 洗必泰，或另一种消毒剂，适用于该地区。
4. 请用锋利的剪刀（约5毫米），无论是在前肢背部或后肢腹部附近（ 图1）以上的微小切口。
5. 删除松散的头发，用钳子切断。如果你愿意，你可以刮胡子鼠标，然后才作出的切口。但是，一个较长的过程，我们发现，这是没有必要以来，如下所示，它不会改善愈合，减少感染，这都是非常罕见的。
6. 2钳拉伸切口才能看到的LN。切口可能达到10毫米。号法律公告出现灰褐色或暗比周围脂肪。
7. 捏用一个镊子的LN上的筋膜（薄膜覆盖的脂肪和组织），轻轻拉，不破坏周围组织。
8. 将第二个钳尽可能underneath的LN。第一镊子，打破筋膜和删除号法律公告。如果您已成功收获的LN，染色的血液应该出现在其中的LN以前所在的位置。需要注意的是等渗溶液中的LN汇。这个简单的测试，让您验证您已提取的一种法律公告，而不是脂肪组织。
9. 确认没有毛发在伤口。
10. 坚持2部分皮肤（皮肤内），装订剪辑，关闭切口。我们使用应用镊子一些米​​歇尔夹。安装1或2个片段，切口的大小而定。大多数情况下，剪辑时脱落的组织愈合。

3。术后护理

1. 笼底部添加一些湿的食物，手术后容易使老鼠能养活。
2. 手术后约6至8小时，检查，以确保他们没有经历过痛苦的小鼠。仔细观察他们的行为（姿势，步态，毛皮的外观与同类和相互作用）。如果小鼠的整体外观差，管理的丁丙诺啡第二剂量。由老鼠第二天应该恢复其正常的行为，否则，继续丁丙诺啡的管理。小鼠从未达到先前确定的，由动物保健理事会接受的终点。你可能想寻求咨询和帮助你照顾动物饲养箱技术员。

4。淋巴结处理

1. 在实验室中，获得单细胞悬液，游离为您常​​用的程序的法律公告。我们LN和对磨砂幻灯片按常规获得1-2×10 ⁶细胞每号法律公告。另外，我们准备RNA提取的LN。
2. 细胞染色为你平时的协议。你应该获得预期的LN流式细胞仪配置文件。

5。代表结果

例如前部和侧散射带够很多经手术或从牺牲的鼠标（ 图2）从麻醉鼠标收获淋巴结。在现场淋巴细胞门的形象和细胞的百分比相同，表明法律公告手术是一个合适的技术，收获细胞。

图1。腹股沟和鼠标臂LN的本地化。 A.腹股沟号法律公告位于略高于后肢，稍往肚子。 B.臂丛LN是位于前腿后面。

LN的手术后得到图2。流量淋巴细胞流式细胞仪轮廓。前部和侧散射剖面显示从麻醉收获的淋巴结（一）经手术或从牺牲的鼠标（二）etized鼠标。淋巴结收获，分离和流式细胞仪分析。细胞在活的淋巴细胞门的百分比显示。

讨论

我们已经描述了LN的手术协议，它可以适用于许多实验系统。虽然非常有益的免疫反应或免疫细胞的平衡，这种技术具有一些限制。首先，只有四个LNS可以收获。二，免疫反应的研究必须是系统性的，或发生在腹股沟浅淋巴结或臂丛（皮肤排出）。最后，收获细胞数号法律公告搬迁的质量，技术的限制，这可能有助于实验变异时需要绝对细胞数的影响。然而，对靶细胞的百分比，对自己，可以提?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
格雷夫精细模式高级钳	哈佛仪器	52-2144	强烈弯曲，10厘米（4英寸），0.8毫米尖
米歇尔剪辑应用和删除钳	哈佛仪器	52-3779	12.5厘米（5）
米歇尔剪辑100	哈佛仪器	52-3746	7.5-1.75毫米
temgesic（盐酸丁丙诺啡）	先灵葆雅
vetalar（盐酸氯胺酮）	boniche动物保健		根据DIN：01989529
rompun（二甲苯胺噻嗪）	拜耳		根据DIN：02169592
异氟醚	雅培		根据DIN：02032384
hypotears眼膏	诺华Ophtalmics		根据DIN：02133288
baxedin（Clorhexidine葡萄糖2％，异丙醇70％）	欧米茄	L0000017	根据DIN：02251477