JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وتستخدم Explants من المخ الأوسط نظام الدوبامين والمخطط في الكولاجين فحص مصفوفة لل في المختبر تحليل مسار التنمية mesostriatal ومخططي سودائي. ويمكن في هذا الاختبار يمكن التلاعب ثمرة محواري والتوجيه وكميا. يمكن أيضا أن يتم تعديل لتقييم مناطق أخرى أو منبهات الجزيئية.

Abstract

الدماغ المتوسط ​​مشروع الدوبامين العصبية (mdDA) عبر حزمة الدماغ الأمامي وسطي نحو عدة مناطق في telencephalon، بما في ذلك المخطط 1. بالتبادل، شائك الخلايا العصبية المتوسطة في المخطط التي تؤدي إلى المسار (مباشر) مخططي سودائي عصب المادة السوداء 2. تطوير هذه المناطق محور عصبي يتوقف على اتخاذ إجراءات اندماجي من عدد كبير من نمو محور عصبي والعظة التوجيه بما في ذلك الجزيئات التي تم إصدارها من قبل neurites أو المناطق المستهدفة من قبل (وسيطة) 3،4. ويمكن دراسة هذه العوامل القابلة للذوبان في المختبر بواسطة mdDA زراعة و / أو explants الجسم المخطط في مصفوفة الكولاجين الذي يوفر الركيزة ثلاثي الأبعاد للمحاور عصبية محاكاة البيئة خارج الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، مصفوفة الكولاجين يسمح لتشكيل التدرجات مستقرة نسبيا من البروتينات الصادرة عن explants الأخرى أو خلايا وضعت في محيط (انظر على سبيل المثال المراجع 5 و 6). نحن هنا وصف طرائق بورification الكولاجين ذيل فأر، microdissection من explants الدوبامين والجسم المخطط وثقافتهم في المواد الهلامية الكولاجين واللاحقة تحليل المناعى والكمية. أولا، العقل المدبر للأجنة الفئران E14.5 هي المعزولة والدوبامين وmicrodissected explants الجسم المخطط. وبعد ذلك هذه explants (CO) مثقف في المواد الهلامية الكولاجين في coverslips لمدة 48 إلى 72 ساعة في المختبر. بعد ذلك، إسقاطات محواري وتصور باستخدام علامات العصبية (هيدروكسيلاز التيروزين على سبيل المثال، DARPP32، أو تويولين βIII) وكميا نمو محور عصبي والاستجابات محور عصبي جذاب أو مثير للاشمئزاز. هذه الخلايا العصبية هو إعداد أداة مفيدة لفي الدراسات المختبرية من الآليات الخلوية والجزيئية للنمو محور عصبي mesostriatal ومخططي سودائي والتوجيه خلال التنمية. باستخدام هذا الفحص، فإنه من الممكن أيضا لتقييم الآخرين (وسيطة) أهداف لمحاور عصبية الدوبامين والجسم المخطط أو لاختبار الاشارات الجزيئية محددة.

Protocol

1. إعداد الكولاجين ذيل الجرذ

  1. جمع 6-10 ذيول الفئران الكبار (كان من الممكن لتخزين المخلفات في -20 درجة مئوية حتى استخدامها).
  2. نقع ذيول في الايثانول 95٪ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT).

تشريح من ذيول الفئران (هود في زراعة الأنسجة):
(الحفاظ على أدوات في الايثانول 70٪ عند عدم استخدامها والتأكد من أن جميع الحلول والأدوات والأواني الزجاجية المستخدمة في هذا الإجراء هي عقيمة)

  1. لجمع الأوتار من ذيول، قطع طرف الذيل. عقد نهاية كبير من الذيل مع زوج من الملقط. استخدام زوج آخر من ملقط لعقد، تثبت وكسر الذيل على مقربة من ملقط الأخرى. مزق وسيتم ترك الأوتار وراء (الشكل 1A، B).
  2. جمع الأوتار في عقيم O 2 H، وبعد جمع كل الأوتار نقلها إلى petridish جديد مع معقم O. 2 H
  3. أخذ 2-3 الأوتار وأجاد لهم باستخدام 2 أزواج من أجلCEPS في petridish جديد مع معقم O. 2 H إزالة غير وتر الأنسجة مثل الأوردة (الأنسجة وتر غير لامعة وعاكسة؛ الشكل 1C). بعد إزالة جميع الأنسجة غير وتر، كل ذيل ينتج ما يقرب من 100-150 ملغ من الأوتار.
  4. نقل الأوتار إلى 300 مل من حمض الخليك معقم 3٪ بين عشية وضحاها ويحرك ببطء في 4 درجات مئوية.
  5. إضافة مبلغ إضافي 200 مل من حمض الخليك معقم 3٪ بين عشية وضحاها ويحرك ببطء في 4 درجات مئوية.
  6. أجهزة الطرد المركزي في حل حامض الخليك الذي يحتوي على الأوتار في XG 2700 ~ لمدة 120 دقيقة في 4 درجات مئوية على الأوتار غير الذائبة بيليه والأنسجة غير وتر.
  7. أثناء الطرد المركزي لإعداد أنابيب غسيل الكلى:
    • قطع قطعة من 40 سم
    • تغلي في EDTA ميكرومتر 500 لمدة 5 دقائق
    • بارد في عقيم O 2 H
  8. عقدة التعادل في واحدة من نهاية الأنابيب غسيل الكلى وملء الأنابيب مع طاف من الحل وتر طرده مركزيا على الجليد في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة باستخدام pipett التلقائيه وماصة 25 مل. تجنب إنتاج الفقاعات. عقدة على الطرف الآخر من الأنبوب وأنبوب مخزن في رقائق الألومنيوم العقيمة على الجليد حتى يتم شغل كل قطعة من الأنبوب (1D الشكل).
  9. إعداد 10 لترات من MEM 0.1X العقيمة، ودرجة الحموضة 4.0، في نسيج الثقافة غطاء محرك السيارة. إضافة إلى العوام قطعة من الأنابيب وإضافة هذه إلى حل قبل تبريد MEM 0.1X في دورق سعة 10. Dialyze بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع التحريك ببطء. هذا غسيل الكلى يزيل حمض الزائد مع الحفاظ على درجة الحموضة منخفضة.
  10. تستبدل بأخرى جديدة قبل المبردة 10 ل 0.1X MEM ويقلب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  11. كرر الخطوة السابقة عن طريق استبدال مع جديد قبل المبردة 10 ل 0.1X MEM ويقلب بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  12. قسامة حل الكولاجين في أنابيب معقمة 50 مل. aliquots مخزن في 4 درجة مئوية. إبقاء 6-12 شهرا، والتعامل مع الأوراق المالية فقط الكولاجين في النسيج هود ثقافة.
  13. من المهم لاختبار ما إذا كان الكولاجين المنقاة يحتاج إلى تخفيفه (0.1x في MEM) للحصول على أفضل النتائج في matr الكولاجينتاسعا فحص. ولذلك، تولد سلسلة تخفيف الكولاجين (collagen غير مخفف، 1:1، 1:02، وتضعف 1:5) وتنفيذ المقايسات مصفوفة الكولاجين كما هو موضح أدناه لتحديد تخفيف الكولاجين الأمثل.

2. تشريح الدماغ المتوسط ​​7،8 الدوبامين

  1. تشريح أجنة الفئران E14.5 من رحم الأم ونضع في L15 المتوسطة على الجليد لحين الحاجة إليها.

يتم تنفيذ كل الخطوات اللاحقة في تشريح L15 المتوسطة على الجليد.

  1. تشريح خارج الدماغ.
  2. إزالة telencephalon عن طريق قطع على طول الجزء الأنسي من كل حويصلة الدماغ الانتهائي (استخدم حويصلات الدماغ الانتهائي للexplants الجسم المخطط).
  3. إزالة غمد السحائي.
  4. جعل خفض ظهري بطني منقاري فقط من الثنية الدماغ المتوسط.
  5. جعل خفض آخر ظهري بطني الذيلية فقط من الثنية الدماغ المتوسط.
  6. جعل خفض rostrocaudal على طول خط الوسط ظهري باستخدام microdissectioن سكين لفضح الكامنة وراء نسيج الدماغ المتوسط ​​بطني. يجب الحرص على عدم ضرب النسيج الدماغ المتوسط ​​بطني كما أنه يحتوي على الخلايا العصبية الدوبامين (الشكل 2).
  7. تقديم اثنين من التخفيضات rostrocaudal الجانبية وبالتوازي مع خط الوسط بطني لإزالة أنسجة الدماغ المتوسط ​​ظهري.
  8. تقسيم ما تبقى من نسيج المخ الأوسط بطني إلى explants باستخدام سكين microdissection.
  9. تخزين explants في L15 المتوسطة التي تحتوي على FBS 5٪ على الجليد حتى الاستخدام.

3. تشريح الجسم المخطط

يتم تنفيذ كافة الخطوات في تشريح L15 المتوسطة على الجليد.

  1. استخدم حويصلات الدماغ الانتهائي خلال تشريح تشريح الدماغ المتوسط.
  2. إزالة المهاد عن طريق خفض في ما بين المهاد والمخطط باستخدام ملقط.
  3. جعل خفض الناصف الوحشي منقاري إلى المخطط لإزالة الهياكل منقاري مثل البصلة الشمية. كرر هذه الخطوة للنسيج يقع caudally إلى المخطط.
  4. موقفالشريحة المتبقية للحصول على رأي الاكليلية من المخطط (الشكل 2).
  5. ويمكن التعرف على المخطط باعتبارها جزءا قليلا أقل كثافة (أكثر شفافية) من الأنسجة. تشريح خارج المخطط ومقطعة إلى explants باستخدام سكين microdissection. تجنب وثيق الأنسجة أغمق قليلا على خط الوسط، الذي يحتوي على الخلايا العصبية المهاجرة من سماحة والعقدية الجانبية وسطي.
  6. تخزين explants في L15 المتوسطة التي تحتوي على FBS 5٪ على الجليد حتى الاستخدام.

4. الجمعية الكولاجين فحوصات مصفوفة

(استخدام تبريد جميع الخطوات على الجليد، نصائح ماصة) إعداد الكولاجين

  1. مزيج 860 ميكرولتر من الكولاجين المخفف مع 100 ميكرولتر من MEM 10X و 40 ميكرولتر من بيكربونات الصوديوم 1M (NaHCO 3) والحفاظ على الجليد. إذا في هذه النقطة الكولاجين دفء سوف يصلب.
  2. إضافة قطرة من 20 ميكروليتر (حوالي 5 ملم قطرا) من الكولاجين استعدادا لساترة في بئر من صحن 4-جيدا نونكوالسماح لها الوقوف في حاضنة CO 2 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 30 دقيقة (المحيط O 2 تركيز غير كاف). خلال هذا الاحتضان فإن الكولاجين يهلم.

شارك في إعداد ثقافة في هلام الكولاجين

  1. بعد الكولاجين ومهيلم، واستخدام ماصة مع طرف 200 ميكروليتر لنقل يزدرع الدوبامين أو الجسم المخطط إلى الكولاجين.
  2. نقل explants على مقربة من بعضها البعض باستخدام إبرة. ابقائهم بعيدا على مسافة قطرها تقريبا واحد ازدراع (~ 200-300 ميكرون) (الشكل 2).
  3. إزالة الزائدة والمتوسطة إضافة 20 ميكرولتر من الكولاجين معدة على أعلى من explants. وسوف يتسبب هذا في كثير من الأحيان explants على التحرك. إعادة وضع explants باستخدام إبرة كما هو موضح في 4.4.
  4. السماح للالكولاجين يصلب لمدة 15 دقيقة في RT تليها 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  5. بعد الكولاجين وضعت، إضافة 400 ميكرولتر من البريدxplant المتوسطة وتنمو لمدة 2-3 أيام في حاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

5. تحليل من قبل المناعية النوعي والكمي

المناعية

  1. لإصلاح explants، إضافة بلطف 400 ميكرولتر من امتصاص العرق 8٪ (منهاج العمل) في برنامج تلفزيوني إلى 400 ميكروليتر من وسط (تمييع بالتالي PFA إلى 4٪) واسمحوا الوقوف لمدة 1 ساعة على RT.
  2. غسل 3X 15 دقيقة في برنامج تلفزيوني في RT.
  3. احتضان في عرقلة العازلة (BB، PBS + 1٪ + FBS تريتون 0.1٪ X-100) لمدة 2 ساعة.
  4. احتضان بين عشية وضحاها مع الجسم المضاد الأولي في BB في 4 درجة مئوية. لمحاور عصبية الدوبامين استخدام الألغام المضادة للأضداد هيدروكسيلاز التيروزين (1:1000) 7، لمحاور عصبية الجسم المخطط مكافحة DARPP32 الأجسام المضادة (1:500) 9 و لتصور كل المحاور لمكافحة βIII تويولين (1:3000) 7.
  5. غسل 5X 1 ساعة في برنامج تلفزيوني في RT.
  6. احتضان مع الجسم المضاد الثانوي مترافق إلى fluorophore المناسب (1:500) في BB بين عشية وضحاها في 4درجة مئوية. من هذه الخطوة على الحد من التعرض للexplants للضوء (مثل غطاء لهم مع رقائق الألومنيوم).
  7. غسل بين عشية وضحاها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية تليها يغسل عدة خلال اليوم التالي.
  8. جبل explants على الشرائح باستخدام مجهر كاشف إطالة Antifade تصاعد المتوسط. إضافة قطرة من ميكرولتر 10 ~ على شريحة ميكروسكوب زجاجية. اتخاذ ساترة ووضعه برفق على انخفاض متوسط ​​المتصاعدة مع الجانب يزدرع أسفل. تجنب محاصرة أي هواء تحت ساترة دي بواسطة جدا خفض برفق على انخفاض متوسط ​​في تصاعد مستمر.

الكمي عن طريق حساب P / D نسبة

  1. الحصول على صور رقمية للexplants باستخدام مجهر epifluorescence (الشكل 3).
  2. باستخدام هذه الصور، وتقسيم كل ازدراع في الأرباع لتوليد رباعي الداني (أي جزء من يزدرع الأقرب إلى ازدراع المجاورة)، ورباعي البعيدة (جزء من يزدرع الأبعد عن تفسيرا المجاورةNT) (الشكل رقم 2، 4).
  3. قياس طول أطول من 20 neurites الناشئة عن يزدرع على حد سواء في الأرباع القريبة والبعيدة.
  4. استخدام متوسط ​​طول neurites 20 اطول لحساب نسبة P / D لكل يزدرع الفردية. ا ف ب / D النسبة> 1 يشير إلى محور عصبي جاذبية، في حين أن نسبة <1 يشير إلى تنافر محور عصبي.
  5. في بعض الحالات، ونمو كثيف من neurites يمنع تقييم طول neurite الفردية. في هذه الحالات، يمكن تنفيذ الكمي عن طريق قياس المسافة بين حافة ازدراع والجبهة الرئيسي للنمو محور عصبي في الأرباع القريبة والبعيدة.

6. ممثل الصور

بعد نجاح ثقافة explants الدوبامين والجسم المخطط على عدد كبير من محاور عصبية واضحة باستخدام مشرق المجهري مجال أو تصور على النحو الذي تويولين كيمياء سيتولوجية مناعية مضادة للβIII (لا يظهر). ومجموعة فرعية من هذه المحاور يكون الدوبامين أو S triatal محاور عصبية كما تصور كيمياء سيتولوجية مناعية باستخدام (الشكل 3). بقسمة explants في الأرباع على النحو المبين وتحديد P / D النسب، يمكن كميا تأثير محور عصبي المفترضة جذاب أو مثير للاشمئزاز (الشكل 3E).

figure-protocol-12656
الشكل 1. صور توضح إعداد الكولاجين من الأوتار ذيل جرذ. أ) سحب بعيدا في ذيل فأر يكشف الأوتار. B) الأوتار مرئية مثل حبل مثل حزم. C) والأوتار من السهل تمييزها عن الأوردة من قبل مثولهم بيضاء لامعة. D) بعد حل الأوتار في حامض الخليك، ينقل حل لأنابيب غسيل الكلى. للحفاظ على البرودة الكولاجين الذائب، يتم وضع أنابيب على رقائق الألومنيوم العقيمة على الجليد.

ه 2 "SRC =" / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg "/>
الشكل 2. تخطيطي يبين الخطوات المختلفة لهذا الإجراء. يتم تشريح مناطق الدماغ المناسب وقطع لتوليد explants. يتم وضع والمخ الأوسط واحدة ويزدرع الجسم المخطط على مقربة في مصفوفة الكولاجين وتترك لتنمو ل48-72 ساعة على 37 درجة مئوية. محاور عصبية وتصور من قبل المناعية مضان ويتم احتساب نسبة P / D لقياس ردود كيميائي التوجه.

figure-protocol-13754
الشكل 3. النتائج الممثل تظهر نمو محور عصبي في الكولاجين ثقافة المصفوفة. A) يزدرع الدماغ المتوسط ​​ملطخة المضادة للأجسام المضادة هيدروكسيلاز التيروزين الكشف ثمرة محور عصبي. خط منقط يشير يزدرع المجاورة. ب) التكبير من neurites ألف فرد تظهر نمو والمخاريط (سهام). C) يزدرع العقدة المخططة ملطخة DARPP32 للسامية. D) التكبير من C تظهر neurites الفردية. E) مثالP / D نسبة الكمي. وتنقسم Explants في الأرباع على قدم المساواة. رباعي القريبة يواجه يزدرع المجاورة في حين أن الربع البعيدة تواجه بعيدا عن ذلك. الحانات النطاق تشير إلى 100 ميكرون.

Discussion

وصف فحص مصفوفة الكولاجين هنا قد استخدمت من قبل وتحسين معامل عديدة ومختلفة في العقود الماضية للتحقيق في مجموعة متنوعة من جزيئات توجيه محور عصبي، ونظم الخلايا العصبية (على سبيل المثال انظر المراجع 5-8). وقد أظهرت هذه الدراسات أن هذا الاختبار هو أداة قوية لدراسة الآثار و?...

Disclosures

ليس لدينا ما يكشف.

Acknowledgements

وقد تم تطوير فحص مصفوفة الكولاجين وتحسن من عمل العديد من المجموعات البحثية المختلفة خلال العقدين أو الثلاثة الماضية. النهج وصفها هنا لexplants الدوبامين والجسم المخطط تستفيد كثيرا من هذه الدراسات. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الكتاب أود أن أشكر Asheeta براساد لمساعدتها في إنشاء ثقافات يزدرع الجسم المخطط. وقد تم تمويل العمل في المختبر من قبل منظمة حدود الإنسان برنامج العلوم (شهادة جائزة التنمية)، والمنظمة الهولندية للبحوث الصحية والتنمية (ZonMW-VIDI وZonMW TOP-)، والاتحاد Europanian (mdDA-NeuroDev، FP7/2007-2011 ، جرانت 222999) (لRJP)، والمنظمة الهولندية للبحوث العلمية (TopTalent؛ إلى ERES).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
الجنين مصل العجل BioWhittaker 14-801F
الجلوتامين (200MM) PAA M11-004
Hepes VWR الدولية 441476L
β-المركابتويثانول ميرك 444203
وسائل الإعلام الأساسية الدنيا (MEM) Gibco 61100-087
Neurobasal Gibco 21103-049
B27 Gibco 17504-044
ليبوفيتز لL-15 متوسطة Gibco 11415-049
البنسلين الستربتوميسين Gibco 15070-063
إطالة الذهب الكاشف Antifade إينفيتروجن P36930
غسيل الأنابيب طيف مختبرات 132660
أرنب المضادة للالتيروسين هيدروكسيلاز PEL-فريز P40101-0
أرنب المضادة للDarpp32 (H-62) سانتا كروز، SC-11365
الماوس المضادة للβIII تويولين سيغما T8660
وصفت اليكسا فلور الأجسام المضادة الثانوية إينفيتروجن

References

  1. van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. Getting connected in the dopamine system. Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).
  2. Lobo, M. K. Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future. Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).
  3. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298, 1959-1964 (2002).
  4. Chilton, J. K. Molecules mechanisms of axon guidance. Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).
  5. Lumsden, A. G., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323, 538-539 (1986).
  6. Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system. Nature. 336, 775-778 (1988).
  7. Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting. J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).
  8. Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem. J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).
  9. Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum. J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).
  10. De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
  11. Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

61 mesostriatal

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved