Dissezione e Cultura del mouse dopaminergici e striatali Espianti di saggi di collagene matrice tridimensionale

Riepilogo

Espianti dal sistema dopaminergico mesencefalo e striato sono utilizzati in un saggio per la matrice di collagene In vitro L'analisi dei pathway di sviluppo mesostriatal e striatonigral. In questo saggio crescita degli assoni e la guida può essere manipolato e quantificati. Può anche essere modificato per valutare altre regioni o segnali molecolari.

Abstract

Mesencefalo dopamina (mdDA) progetto di neuroni attraverso il fascio proencefalo mediale verso diverse aree del telencefalo, compreso il corpo striato ^1. Reciprocamente, i neuroni spinosi medi del corpo striato che danno luogo alla striatonigral (diretto) via innervano la substantia nigra ^2. Lo sviluppo di questi tratti assoni dipende dalle azioni combinatorie di una pletora di crescita degli assoni e spunti di orientamento tra le molecole che vengono rilasciati dai neuriti (o intermedio) regioni obiettivo ^3,4. Questi fattori solubili possono essere studiate in vitro da mdDA coltura e / o espianti striatali in una matrice di collagene che fornisce un substrato tridimensionale per gli assoni che mimano l'ambiente extracellulare. Inoltre, la matrice di collagene consente la formazione di gradienti relativamente stabili di proteine ​​rilasciate da espianti altri o cellule poste in prossimità (ad esempio si vedano i riferimenti 5 e 6). Qui si descrivono i metodi per i PURificazione di collagene coda di ratto, microdissezione di espianti dopaminergici e striatali, la loro cultura in gel di collagene e la successiva analisi immunoistochimica e quantitativa. In primo luogo, E14.5 il cervello di embrioni di topo sono isolate e dopaminergici e striatali espianti sono microdissezionate. Questi espianti sono poi (co) coltivati ​​in gel di collagene su vetrini coprioggetto per 48 a 72 ore in vitro. Successivamente, le proiezioni assonali sono visualizzati utilizzando marcatori neuronali (ad esempio la tirosina idrossilasi, DARPP32 o tubulina βIII) e la crescita degli assoni e le risposte degli assoni attrattiva o repulsiva vengono quantificati. Questa preparazione neuronale è uno strumento utile per studi in vitro dei meccanismi cellulari e molecolari della crescita degli assoni e mesostriatal striatonigral e guida durante lo sviluppo. Usando questo saggio, è anche possibile valutare altri (intermedio) obiettivi per assoni dopaminergici e striatali o per testare specifici segnali molecolari.

Protocollo

1. Preparazione di collagene Rat Tail

1. Raccogliere 6-10 code di ratto adulto (è possibile immagazzinare le code a -20 ° C fino al momento dell'uso).
2. Bagnare le code in 95% etanolo notte a temperatura ambiente (RT).

Dissezione di code di ratto (in cappa di coltura tissutale):
(Tenere gli strumenti in etanolo al 70% quando non li utilizzano e assicurarsi che tutte le soluzioni, strumenti e oggetti in vetro utilizzati durante tutta la procedura sono sterili)

3. Per raccogliere tendini dalle code, tagliare la punta della coda. Tenere estremità grande della coda con una coppia di pinze. Utilizzare un altro paio di pinze per tenere, piegare e rompere la coda vicino alle pinze altri. Scomporre e dei tendini sarà lasciato alle spalle (figura 1A, B).
4. Raccogliere i tendini in H ₂ O sterile e dopo aver raccolto tutti i tendini spostarli in una nuova petridish sterile H ₂ O.
5. Prendere 2-3 tendini e distruggeteli con 2 paia di perfunghi porcini in un petridish nuovo sterile H ₂ O. Smontare il dispositivo anti-tendinea dei tessuti, come le vene (tessuto tendineo è lucido e riflettente; Figura 1C). Dopo la rimozione di tutti i non-tessuto del tendine, ogni coda produce circa 100-150 mg di tendini.
6. Trasferire i tendini a 300 ml di soluzione sterile 3% di acido acetico e mescolare lentamente per tutta la notte a 4 ° C.
7. Aggiungi un ulteriore 200 ml di soluzione sterile di acido acetico al 3% e mescolare lentamente per tutta la notte a 4 ° C.
8. Centrifugare la soluzione di acido acetico contenente i tendini a ~ 2700 xg per 120 min a 4 ° C a pellet non disciolti tendini e non-tessuto tendineo.
9. Durante la centrifugazione preparare tubo di dialisi:
   • tagliare pezzi di 40 cm
   • bollire in 500 mM EDTA per 5 min
   • cool in sterile H ₂ O
10. Tie un nodo ad una estremità del tubo di dialisi e riempire il tubo con il surnatante della soluzione tendine centrifugato su ghiaccio nella cappa coltura tissutale utilizzando un sistema automatico pipette 25 e una pipetta ml. Evitare la produzione di bolle. Nodo l'altra estremità del tubo e il tubo negozio lamina di alluminio sterile su ghiaccio fino a che tutti i pezzi di tubo vengono riempiti (Figura 1D).
11. Preparare 10 l di 0,1 X. MEM sterile, pH 4.0, in cappa coltura tissutale. Aggiungere galleggiante a pezzi di tubo e aggiungerli al pre-raffreddata 0,1 X. soluzione MEM in un becher 10 l. Dializzare notte a 4 ° C mentre lentamente sotto agitazione. Questo dialisi rimuove l'eccesso di acido mantenendo il pH basso.
12. Sostituire con una nuova pre-raffreddato 10 l 0,1 X. MEM e mescolare per una notte a 4 ° C.
13. Ripetere il passaggio precedente, sostituendo con il nuovo pre-raffreddato 10 l 0,1 X. MEM e mescolare per una notte a 4 ° C.
14. Aliquotare soluzione di collagene in sterili provette da 50 ml. Aliquote Conservare a 4 ° C. Tenere 6-12 mesi, gestire solo lo stock di collagene nella cappa coltura tissutale.
15. È importante per verificare se il collagene purificato deve essere diluito (in 0.1x MEM) per ottenere risultati ottimali nel matr collageneix saggio. Pertanto, generare una serie di diluizioni di collagene (collagene non diluito, 1:1, 1:2 e 1:5 diluito) ed eseguire saggi matrice di collagene come descritto di seguito per determinare la diluizione ottimale collagene.

2. La dissezione del mesencefalo dopaminergici ^7,8

1. Dissect E14.5 embrioni di topo dall'utero della madre e mantenere in medio L15 su ghiaccio fino al momento dell'uso.

Tutte le fasi successive sono eseguite dissezione in L15 mezzo su ghiaccio.

2. Sezionare il cervello.
3. Rimuovere il telencefalo tagliando lungo la parte mediale di ogni vescicola telencefaliche (utilizzare le vescicole telencefaliche per espianti striatali).
4. Rimuovere la guaina meningea.
5. Fare un taglio dorsoventrale solo rostrale della flessione mesencefalico.
6. Fare un altro taglio dorsoventrale appena caudalmente della flessione mesencefalico.
7. Fare un taglio lungo la linea mediana rostrocaudal dorsale con un microdissection coltello per esporre il tessuto sottostante mesencefalo ventrale. Fare attenzione a non colpire il tessuto mesencefalo ventrale in quanto contiene i neuroni dopaminergici (Figura 2).
8. Fate due tagli rostrocaudal laterale e parallelamente alla linea mediana ventrale per rimuovere il tessuto dorsale mesencefalo.
9. Dividere il tessuto rimanente mesencefalo ventrale in espianti con un coltello microdissezione.
10. Conservare gli espianti in L15 terreno contenente 5% di FBS su ghiaccio fino al momento dell'uso.

3. La dissezione dello striato

Tutte le fasi sono eseguite in dissezione L15 mezzo su ghiaccio.

1. Utilizzare vescicole telencefaliche sezionati durante la dissezione mesencefalo.
2. Rimuovere il talamo tagliando tra il talamo e corpo striato con pinze.
3. Fare un taglio medio-laterale anteriore del corpo striato per rimuovere le strutture rostrali come il bulbo olfattivo. Ripetere questo passaggio per il tessuto situato caudalmente al corpo striato.
4. Posizionela porzione rimanente per ottenere una vista coronale del corpo striato (Figura 2).
5. Il corpo striato può essere riconosciuto come una parte un po 'meno densa (più trasparente) del tessuto. Sezionare il corpo striato e tagliarla a espianti con un coltello microdissezione. Evitare la chiusura dei tessuti leggermente più scura alla linea mediana, che contiene neuroni che migrano di eminenza laterale e mediale gangliare.
6. Conservare gli espianti in L15 terreno contenente 5% di FBS su ghiaccio fino al momento dell'uso.

4. Assemblaggio matrice di collagene saggi

Preparazione del collagene (tutti i passaggi su ghiaccio, raffreddato ad utilizzare puntali)

1. Miscelare 860 pl di collagene diluito con 100 pl di MEM 10x e 40 pl di bicarbonato di sodio 1M (NaHCO ₃₎ e mantenere in ghiaccio. Se a questo punto il collagene riscalda che si solidifichi.
2. Aggiungere una goccia di 20 pl (circa 5 mm di diametro) di collagene preparato ad una coverslip in un pozzo di un 4-ben piatto Nunce lasciate riposare in un incubatore a CO ₂ 37 ° C e 5% CO ₂ per 30 min (ambiente concentrazione di O ₂ è sufficiente). Durante questa incubazione il collagene gelatinizzare.

Setup co-coltura in gel di collagene

3. Dopo che il collagene è gelatinizzato, utilizzare una pipetta con una punta di 200 pl per trasferire un espianto o dopaminergica striatale al collagene.
4. Spostare gli espianti in stretta prossimità l'uno all'altro usando un ago. Tenere separati ad una distanza di approssimativamente del diametro di un espianto (circa 200-300 micron) (Figura 2).
5. Rimuovere eccesso di terreno e aggiungere 20 ul di collagene preparato sopra degli espianti. Questo spesso causa degli espianti di muoversi. Riposizionare gli espianti utilizzando un ago, come descritto in 4.4.
6. Sia il collagene solidificare per 15 min a temperatura ambiente seguita da 30 minuti a 37 ° C e 5% CO _2.
7. Dopo che il collagene ha fissato, aggiungere 400 microlitri di emedie xplant e crescere per 2-3 giorni in un incubatore a CO ₂ 37 ° C e 5% CO _2.

5. Analisi di immunoistochimica e quantificazione

Immunoistochimica

1. Per risolvere espianti, delicatamente aggiungere 400 microlitri di 8% paraformaldeide (PFA) in PBS a 400 microlitri di media (e quindi diluendo la PFA al 4%) e lasciar riposare per 1 ora a RT.
2. Lavare 3 volte 15 min in PBS a temperatura ambiente.
3. Incubare in tampone di bloccaggio (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) per 2 ore.
4. Incubare con anticorpo primario in BB a 4 ° C. Per assoni dopaminergici utilizzano anticorpi anti-tirosina idrossilasi (1:1000) ^7, per assoni striatali anticorpi anti-DARPP32 (1:500) ⁹ e per la visualizzazione di tutti i assoni βIII anti-tubulina (1:3000) ^7.
5. Lavare 5x 1 ora in PBS a temperatura ambiente.
6. Incubare con anticorpo secondario coniugato al fluoroforo appropriata (1:500) in BB notte a 4° C. Da questo passaggio per minimizzare l'esposizione degli espianti alla luce (ad esempio, coprire con un foglio di alluminio).
7. Lavare tutta la notte in PBS a 4 ° C, seguita da numerosi lavaggi durante il giorno successivo.
8. Montare espianti su un vetrino portaoggetti con Prolungare reagente Antifade mezzo di montaggio. Aggiungere una goccia di ~ 10 microlitri su un vetrino per microscopio. Prendere il vetrino e delicatamente immissione sul goccia di soluzione di montaggio con il lato rivolto verso il basso espianto. Evitare di inglobare l'aria sotto de coprioggetto da molto delicatamente abbassare la goccia di soluzione di montaggio.

Quantificazione calcolando P / D rapporto

9. Acquisire immagini digitali degli espianti usando un microscopio a epifluorescenza (Figura 3).
10. Utilizzando queste immagini, dividere ogni espianti in quadranti per generare un quadrante prossimale (cioè parte del espianto più vicino al espianto adiacente) e un quadrante distale (parte del espianto più lontana dalla spiegazione adiacentent) (Figura 2, 4).
11. Misurare la lunghezza di 20 più lunghe neuriti emergenti dalla espianto sia nei quadranti prossimale e distale.
12. Utilizzare la lunghezza media delle 20 più lunghe neuriti per calcolare il rapporto P / D per ogni singolo espianto. AP / D rapporto> 1 indica attrazione assone, mentre un rapporto <1 indica la repulsione degli assoni.
13. In alcuni casi, la crescita di neuriti densa impedisce la valutazione della lunghezza neurite individuale. In queste situazioni, la quantificazione può essere effettuata misurando la distanza tra il bordo del espianto e il fronte principale della crescita assonale nei quadranti prossimale e distale.

6. Immagini di rappresentanza

Dopo cultura di successo di espianti dopaminergici e striatali un gran numero di assoni sono visibili mediante microscopia luminosa campo o come visualizzato da anti-βIII immunoistochimica tubulina (non mostrato). Un sottoinsieme di questi assoni sarà dopaminergica o s assoni triatal come visualizzato immunocitochimica utilizzando (Figura 3). Dividendo gli espianti in quadranti come descritto e determinare P / D rapporti, un effetto assone putativo attrattiva o repulsiva può essere quantificato (Figura 3E).

Figura 1. Foto che illustrano la preparazione di collagene da tendini coda di ratto. A) Tirando a parte la coda di topo espone i tendini. B) I tendini sono visibili come corda come bundle. C) I tendini sono facili da distinguere dalle vene per il loro aspetto bianco lucido. D) Dopo dissoluzione dei tendini in acido acetico, la soluzione viene trasferita al tubo di dialisi. Per mantenere il freddo disciolto collagene, provette sono poste su un foglio di alluminio sterile su ghiaccio.

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Figura 2. Schematica indicante le varie fasi della procedura. Regioni cerebrali appropriate vengono sezionati e tagliati a generare espianti. Un singolo mesencefalo e espianto striatale sono posizionati in stretta prossimità in una matrice di collagene e lasciati crescere per 48-72 ore a 37 ° C. Gli assoni sono visualizzati mediante immunoistochimica a fluorescenza e un rapporto P / D è calcolato per quantificare le risposte chemotropic.

Figura 3. I risultati rappresentativi mostrano la crescita degli assoni in una cultura matrice di collagene. A) espianto mesencefalo colorate con anticorpo anti-tirosina idrossilasi rivelando l'estensione assonale. Linea tratteggiata indica espianto adiacente. B) ingrandimento di un neuriti che mostrano individuali e coni di crescita (frecce). C) espianto striatale colorate con anticorpi anti-DARPP32. D) Ingrandimento del C mostrando neuriti individuali. E) Esempio diRapporto P / D quantificazione. Espianti sono suddivisi in quadranti uguali. Il quadrante prossimale si trova di fronte l'espianto adiacente, mentre il quadrante distale si trova ad affrontare a partire da esso. Barre di scala indicano 100 micron.

Discussione

Il saggio matrice di collagene qui descritto è stato utilizzato e migliorato da molti laboratori diversi negli ultimi decenni a indagare su una varietà di molecole e sistemi di orientamento degli assoni neuronali (ad esempio si vedano i riferimenti 5-8). Questi studi hanno dimostrato che questo dosaggio è un potente strumento per studiare gli effetti e la regolazione delle molecole di orientamento degli assoni secrete da diversi (intermedio), tessuti bersaglio.

Tuttavia, occorre notare ch...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reattivo	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Di siero di vitello fetale	BioWhittaker	14-801F
Glutammina (200mm)	PAA	M11-004
Hepes	VWR International	441476L
β-mercaptoetanolo	Merck	444203
Minimi Essential Media (MEM)	Gibco	61100-087
Neurobasal	Gibco	21103-049
B27	Gibco	17504-044
Leibovitz L-15	Gibco	11415-049
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15070-063
Prolungare Reagente oro Antifade	Invitrogen	P36930
Dialisi tubi	Spectrum Labs	132660
Coniglio anti-tirosina idrossilasi	Pel-Freez	P40101-0
Coniglio anti-Darpp32 (H-62)	Santa-Cruz	Sc-11365
Topo anti-tubulina βIII	Sigma	T8660
Alexa Fluor etichettato anticorpi secondari	Invitrogen