تجميد مستورقة، التشعيع جزئي، والنسج

Summary

وصفت وسيلة فعالة لتطعيم الأنسجة من حجم محدد وثابت بين المستورقات. كما تضمنت وصفا للطريقة التي يمكن أن تتكيف تقنية تجميد المستخدمة لزراعة الأعضاء، وبالتزامن مع دروع الرصاص، لتشعيع جزئي للحيوانات الحية.

Abstract

أثبت مستورقة، والديدان والمياه العذبة، ليكون نظاما قويا للتشريح تجديد metazoan و ^1،2 بيولوجيا الخلايا الجذعية. يتم تجديد مستورقة من أي الأنسجة المفقودة أو التالفة ممكن من الخلايا الجذعية البالغة ووصف neoblasts ^3. وعلى الرغم من هذه الخلايا الجذعية أظهرت بشكل قاطع أن تكون ذات قوة تناسلية متعددة وقادرة على إعادة تشكيل متفرد من حيوان كامل ^4، وعدم التجانس داخل الخلية الجذعية السكان وديناميات تصرفاتهم الخلوية لا تزال دون حل إلى حد كبير. نظرا للعدد الكبير وتوزيع واسعة من الخلايا الجذعية في جميع أنحاء الجسم مستورقة خطة، وهناك حاجة إلى أساليب متقدمة لمعالجة جزء من السكان الخلايا الجذعية لدراسة الجزيئية والوظيفية في الجسم الحي.

زراعة الأنسجة والتشعيع جزئي طريقتان يمكن من خلالها عزل جزء من السكان للخلايا الجذعية مستورقة لمزيد من الدراسة. كل تقنية لها مزايا واضحة. تيزرع قضية تسمح لإدخال الخلايا الجذعية، إلى مجموعة من السذاجة، التي إما أن تكون بطبيعتها المتميزة وراثيا أو قد تمت معالجتها من قبل دواء. بدلا من ذلك، التشعيع جزئي يسمح لعزل الخلايا الجذعية ضمن مجموعة، جنبا إلى جنب إلى الأنسجة خالية من الخلايا الجذعية، من دون إدخال أي جرح أو المؤخرة في سلامة الأنسجة. باستخدام هاتين الطريقتين، يمكن للمرء أن التحقيق في العوامل خلية مستقلة وغير مستقلة، أن وظائف التحكم في الخلايا الجذعية، مثل انتشار الأسلحة النووية، والتمايز، والهجرة.

وقد استخدمت كل من زرع أنسجة ^5،6 وجزئية تشعيع ⁷ تاريخيا في تحديد العديد من الأسئلة حول تجديد مستورقة التي لا تزال قيد الدراسة اليوم. ومع ذلك، ظلت هذه التقنيات بالشكل الكافي نظرا لطبيعة شاقة وغير متناسقة من الطرق السابقة. البروتوكولات المعروضة هنا تمثل خطوة كبيرة إلى الأمام في خفض الوقتالثانية والجهد اللازم لتوليد بتكاثر أعداد كبيرة من الحيوانات المطعمة أو المشع جزئيا مع efficacies تقترب من 100 في المئة. نحن تغطي ثقافة الحيوانات الكبيرة، الشلل، والتحضير لتشعيع جزئي، وزرع الأنسجة، وتعظيم الاستفادة من انتعاش الحيوانية. وعلاوة على ذلك، فإن العمل الموصوفة هنا يظهر أول تطبيق للطريقة التشعيع جزئي للاستخدام مع معظم مستورقة درس على نطاق واسع، Schmidtea البحر الأبيض المتوسط. بالإضافة إلى ذلك، الأنسجة كفاءة التطعيم في المستورقات يفتح الباب امام اختبار وظيفي من مجموعات سكانية فرعية من الخلايا الجذعية من السذاجة أو المعالجة في إعادة تعمير المقايسات، التي طالما كانت طريقة الذهب القياسية من يعاير الكبار المحتملة الخلايا الجذعية في الثدييات ^8. وسوف تبني واسع من هذه التقنيات مما لا شك فيه تؤدي إلى فهم أفضل للسلوكيات الخلوية من خلايا جذعية للبالغين خلال توازن الأنسجة وتجديدها.

Protocol

ملاحظة: هذا البروتوكول يشير إلى استخدام المواد الخطرة (الرصاص وchloretone). اكتساب، وقراءة، واتبع MSDS لجميع المواد الخطرة.

1. الثقافة حيوان، اختيار، وتحضير

1. للثقافة الحيوانية والمياه المعالجة مستورقة استخدام (1X أملاح مونتجويك ^9)، ونقل الماصات البلاستيكية.
2. ويمكن استخدام الجنسي نمط حيوي Schmidtea البحر الأبيض المتوسط ​​عندما أثيرت في المختبر في ظل ظروف طبيعية ثقافة ^10. لإنتاج عينات لاجنسي من حجم المطلوبة، S. أثار البحر الأبيض المتوسط ​​في درجة حرارة الغرفة في ظل ظروف طبيعية ويجب أن تغذى في ⁹ مزدوجة للتردد العادي الثلاثي (2-3 مرات في الأسبوع) لشهر أو شهرين قبل استخدامها. بدلا من ذلك، أن تبقى الحيوانات اللاجنسي تتغذى على التردد العادي في 10 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى من اجل زيادة حجمها متوسط.
3. تحديد الحيوانات التي هي ما بين 1 إلى 2 سم فيوعلى نطاق أوسع من طول 2 ملم ثم تجويع الحيوانات 3-7 ايام قبل استخدامها.
4. إذا أداء أي العلاجات الدوائية أو إشعاعية على المضيفين المقصود، والجهات المانحة، أو الحيوانات المشع جزئيا، تنفيذ معاملة (ق) في هذه المرحلة.
5. إذا تم تنفيذ العلاجات الدوائية التي تتطلب تغذية الحيوانات، وتجويع الحيوانات مبلغ إضافي قدره 3 الى 7 ايام قبل استخدامها.

2. إعداد حلول ومواد

1. يعد حل chloretone، وهو مخدر خفيف المحلية، عن طريق تذويب 0،1-0،2٪ وزن / حجم chloretone في المياه مستورقة وتقشعر لها الأبدان الحل على الجليد.
2. إذا المنفذ التشعيع جزئي فقط، انتقل إلى الخطوة 2.7. لزرع الأنسجة يستمر إلى الخطوة 2.3.
3. باستخدام موقد بنسن، تثبت قطرها 0،75 ملم الداخلية، وتستخدم لقطع الأنسجة الكسب غير المشروع، و 0.7 ملم القطر الخارجي، وتستخدم لخلق ثقب في الدولة المضيفة التي سوف تحصل على الكسب غير المشروع، والأنابيب الشعرية إلى 90 درجة زاوية في 1-2 سم من نهاية EAالفصل أنبوب. لحفظ المواد، وثني طرفي كل الأنابيب الشعرية والخروج منها في نصف لانتاج اثنين من الأدوات. والحرص على عدم لهب نهايات جدا من الأنابيب.
4. قطع الأوراق التالية إلى أحجام المشار إليه:
   • أسود مرشح ورقة (يقتطع حوالي المستطيلات. 2.5 سم × 1.5 سم)
   • Whatman رقة الترشيح رقم 3 (يقتطع حوالي المستطيلات. 2 سم × 0.5 سم)
   • Kimwipe (مطوية ويقتطع حوالي الحشوات. 3 سم × 0.5 سم × 4 رقائق)
   • ورق السجائر المتداول (إزالة الشريط اللثة ويقتطع حوالي المستطيلات. 3 سم × 2 سم)
5. إعداد تعديل Holtfreter في حل (3.5 غرام / لتر كلوريد الصوديوم، 0.2 جم / لتر NaHCO _3، 0.05 غ / ل بوكل، 0.2 جم / لتر MgSO _4، 0.1 غ / لتر CaCl _2، ودرجة الحموضة 7،0-7،5) والكازين المشبعة حل Holtfreter والبرد على حد سواء إلى 4 درجات مئوية.
6. إرفاق Kimwipe مطوية على شكل مربع من Parafilm ووضعت على لوحة برودة بلتيير أو غيرها من جهاز التبريد الواقعة تحت المجهر تشريح. تشبع Kimwipe مع Holtf المبردةreter في حل ومكان 2 أسود المستطيلات ورقة تصفية على Kimwipe.
7. خط أطباق بتري مع ورقة # 2 Whatman مرشح. بلل ورقة الترشيح مع حل Holtfreter والبرد الأطباق على الجليد. قد لتشعيع جزئي يمكن استخدام أكبر صحن وتصفية الخطوط الملاحية المنتظمة ورقة.

3. تخدير والشلل

1. ملء طبق بيتري مع حل chloretone المبردة والديدان الماصة في طبق. لزرع تخدير واحد فقط مضيف وجهة مانحة واحدة في وقت واحد. للإشعاع يمكن أن العديد من جزئية (ن> 10) الحيوانات تكون تخدير في آن واحد.
2. السماح للديدان للانغماس في حل chloretone حتى تصبح بلا حراك (5-10 دقيقة).
3. شطف الديدان بواسطة pipetting لهم في صحن مليء حل Holtfreter مبرد لل.
4. لشل حركة الحيوانات pipetting لهم على ورقة مرشح أسود مشبع حل Holtfreter المبردة وتوجيههم الجانب أسفل بطني بالملقط. إذا الحيوانات قادرة على الموضعomote، وتمتص حل Holtfreter الزائدة، وانخفاضا طفيفا في درجة الحرارة من بلتيير الخاص بك أو لوحة الباردة، أو يزيد من طول فترة العلاج chloretone.

4. جزئي تشعيع

ملاحظة: اتبع هذه الخطوات لإعداد الحيوانات للإشعاع جزئي. إذا أداء زرع بدلا من ذلك، انتقل إلى القسم 5.

1. وضع طبق بيتري المبردة من الخطوة 2.7 على الجليد في دلو الثلج التي تناسب داخل مصدر الأشعة السينية أعلى irradiator.
2. ترتيب الحيوانات تخدير في طبق بيتري عن طريق تحريك ورقة سوداء على مرشح والتي يجمد فيها. قد يؤدي استخدام ملقط لتحريك الديدان تخدير مباشرة جرح منهم.
3. ترتيب نقل الحيوانات إلى مصدر قمة الأشعة السينية irradiator وضعه في وعاء الثلج بحيث يتم التقليل من المسافة من أنبوب الكاثود إلى الحيوانات، مما يضاعف من معدل الجرعة الفعالة.
4. موقف درع الرصاص (ق) (الشكل 1) بين الحيوانات وتي الكاثودUBE على النحو المرغوب فيه. وينبغي أن الدروع الواقية من 4،5-6 مم للسماح لتخفيف 97٪ إلى 99 من شعاع الأشعة السينية 325kV ^11.
5. تقديم جرعة الأشعة السينية. إذا كانت هناك رغبة كاملة الاجتثاث الخلايا الجذعية من غير محمية المناطق، وتسليم 30 جراى أو أكبر باستخدام irradiator الأشعة السينية. للإشارة، 30 جراى ما يعادل 3.6 دقيقة في 320 كيلو فولت و 10 مل أمبير في الدقيقة الأشعة السينية مع شركة XRAD320 مسافة حقل إلى مصدر من 30 سنتيمترا.
6. فورا بعد اكتمال الجرعات، والتعامل مع الديدان بواسطة ورقة مرشح أسود، نقل الحيوانات في الماء مستورقة مبردة. السماح للماء مستورقة لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة والحيوانات لطرد أنفسهم من ورقة مرشح أسود. الإجراء التشعيع جزئي اكتمال الآن.

5. زرع أنسجة

1. باستخدام ماصة نقل وملقط، وترتيب المضيف تخدير والديدان المانحة في المستطيلات منفصلة من ورقة مرشح أسود على Kimwipe الذي تم تبريده على اتحاد التنس الاندونيسىإيه أو برودة لوحة تحت المجهر تشريح.
2. باستخدام أنبوب 0،75 ملم القطر الداخلي الشعرية قطع التيار الكسب غير المشروع من الجهات المانحة و، وذلك باستخدام ملقط، وضعه على الخروج من جزء وسيلة للمضيف. إذا يحصل عالقا المواد الكسب غير المشروع في الأنابيب الشعرية، طرد بالملقط.
3. باستخدام أنبوب 0.7 مم القطر الخارجي الشعرية إزالة المكونات من المضيف، واستخدام الملقط موقف الكسب غير المشروع في الحفرة التي تركوها وراءهم.
4. نقل المضيف المزروعة على موقعها أسود المستطيل ورقة مرشح في طبق بيتري أعدت في الخطوة 2.7.
5. تبلل قطعة من الورق المتداول مع حل الكازين Holtfreter المشبعة، ووضعه على رأس المضيف المزروعة كما diagramed في الشكل 2A.
6. نقع أربع قطع من ورق الترشيح في حل الكازين Holtfreter ومشبع وغلف المضيف المزروعة كما diagramed 2B في الشكل.
7. نقع 4 الحشوات من Kimwipe خفض في حل الكازين Holtfreter ومشبعة، وتضع لهم على مدىورقة الترشيح من الخطوة 5.6 (الشكل 2B). استبدال غطاء ووضع طبق بيتري على الجليد.
8. نقل دودة المانحة في الماء مستورقة لاسترداد، وشفاء، وتجديد.
9. عندما يتم الانتهاء من جميع عمليات زرع، ووضع الديدان المزروعة في الحاضنة 10 درجة مئوية خلال الليل.
10. في صباح اليوم التالي، مع الحرص على عدم تعكير صفو الكسب غير المشروع، والكشف عن الدودة وتحويلها (على الورق لمرشح أسود) إلى طبق بيتري مملوءة بالماء المستورقات.
11. إما السماح لدودة لاخراج نفسها من ورقة الترشيح أو إزالتها برفق بالملقط.
12. تغيير المياه مستورقة مرة واحدة كل 2-3 أيام.

6. ممثل النتائج

على الفور وبعد التشعيع جزئي المستورقات تبدو طبيعية وغير متأثر. اعتمادا على جرعة وتسليمها الهندسة للدرع المستخدمة، قد الأنسجة المشع الوراء، بل وحتى تتفكك ^7. وينبغي أن الأنسجة محمية لا تزال سليمة. الفلبسبب تراجع الأنسجة وفقدان سلامة الأنسجة، وسوف مأرمة النموذج وسيتم إعادة إنشاء هياكل المفقودين (3A الشكل). إذا تم إجراء بتر في المنطقة المشع جزئيا، سيتم انقاذ النسيج المشع (منع أي تراجع أو من التفكك) (الشكل 3B). في يصب بأذى على حد سواء وسيتم تأجيل تجديد حالة بتر بالمقارنة مع 1 المستورقات غير المشع بتر (الشكل 3C). إذا تم تسليم جرعة الأشعة السينية من 30 غراي والحيوانية المعرضة للإشعاع جزئيا لم يصب بأذى، الخلايا الجذعية الناجحة الاجتثاث في نمط ويمكن التأكد من المقابلة مع درع الرصاص المستخدم 2 إلى 3 أيام بعد التشعيع جزئي بواسطة التهجين الموضعي للخلايا الجذعية علامة Smed-PIWI-1 ¹² (ويعرف أيضا باسم smedwi-1) (الشكل 4).

وينبغي في الصباح بعد الزرع، وطعم النجاح في الأنسجة المزروعة تكون واضحة ثithin النسيج المضيف، بعد أن انضمت إلى كل من السطوح الظهرية والبطنية للمضيف (الشكل 5A). في بعض الأحيان، فإن الكسب غير المشروع التمسك سطح فقط بطني أو ظهري. إذا كان زرع ناجحة تماما، وسوف لا علامة على الكسب غير المشروع أن تكون واضحة من سطح إما الظهرية أو البطنية للمضيف (الشكل 5B). بعد وقت قصير من الكسب غير المشروع ناجح من غير المشع الأنسجة إلى المضيف الذي كان قد ذاب من الخلايا الجذعية بواسطة أشعة قاتلة ^13،14، في التهجين في الموقع لSmed PIWI-1-سوف تكشف عن أن الخلايا الجذعية موجودة في المقام الأول في الكسب غير المشروع (الشكل 5C ). بالإضافة إلى ذلك، سوف ترقيع ناجحة من غير المشع الأنسجة إلى المضيفين المشع القاتلة يؤدي إلى إنقاذ نسيج المضيف، والبقاء على المدى الطويل للمضيف ^15.

الشكل 1. عام ترتيب المكون الأساسيق للإشعاع جزئي. وفي irradiator الأشعة السينية مع مصدر أعلى للأشعة السينية وضعه (أنبوب الكاثود) يتم وضع مستورقة تخدير مباشرة تحت مصدر الأشعة السينية في مجال الإشعاع. من أجل تعظيم معدل جرعة الأشعة السينية، ينبغي التقليل من المسافة بين مستورقة ومصدر الأشعة السينية. وينبغي وضع درع الرصاص بين أنبوب الكاثود ودودة تخدير، أقرب إلى دودة ممكن عمليا. وينبغي تصميم الدرع الرصاص، وتصنيعها، ووضعها بحيث تحمي الأنسجة المطلوب تماما ولكن الكشف عن ما تبقى من دودة. التجارية العديد من المصنوعات سوف تنتج دروع الرصاص مخصصة من الرسم التخطيطي تصميم بسيط، ونحن قد استخدمت بنجاح ألفا أنظمة شركة (Bluffdale، UT). يجب أن تكون سميكة الرصاص بما يكفي للسماح للمبلغ المطلوب من التدريع. على سبيل المثال، إذا كان المطلوب شبه الكامل يحمي من أشعة السينية 320 كيلو فولت، وينبغي أن يكون زمام المبادرة 4،5-6 مم. يتم وضع مستورقة ودرعا فيواصطف ورقة Holtfreter لمرشح غارقة طبق بيتري التي تقع في دلو الجليد. يعطى كبيرة بما فيه الكفاية مجال الإشعاع الأشعة السينية، وعدد من الدروع الرصاص متطابقة، قد يكون العديد من العينات المشع جزئيا في وقت واحد (وليس في الصورة).

الشكل 2. بناء غرفة الإنعاش. (أ) نظرا للانتعاش انفجرت غرفة زراعة الأنسجة، والتي تبين كل من المكونات التي يتم طبقات فوق بعضها البعض بعد النقع في محلول الكازين Holtfreter ومشبعة. (ب) غرفة الإنعاش على وشك الانتهاء، مما يدل على وضع المتشابكة للWhatman # 3 مستطيلات ورقة مرشح بشكل مريح الذي سيحتوى مستورقة تخدير، ومنع الحركة أثناء الشفاء. بناء دقيق للغرفة الإنعاش يمنع حركة الحيوان وجفاف، وتعزيز الشفاء السريع، وزيادة فعالية عمليات زرع الأنسجة.

الشكل 3. ممثل نتائج جزئية بسيطة إشعاع الخلفية. كما وصف دوبوا ^7، (A) عندما كانت محمية في النصف الخلفي من planarians مع الرصاص وتعرضت بعد ذلك إلى الأشعة السينية أشعة لوحظ في النسيج الأمامي إلى الوراء مرة أخرى إلى الحدود بين المشع ومحمية في الأنسجة التي blastemas نقطة unpigmented شكلت والحيوانات وبدأت على التجدد. (ب) من ناحية أخرى، عندما تم قطع رأس الحيوانات بعد التشعيع الجزئي نفسه يؤديها في (أ)، لوحظ تراجع الأنسجة وليس وانه تم انقاذ ما تبقى من نسيج الأمامي المشع. ومقطوعة الرأس الحيوانات المشع جزئيا رؤساء مجدد (B)، ومع ذلك، فقد تأخر كثيرا تجديد بالمقارنة مع الضوابط مقطوعة الرأس غير المشع (C).

الشكل 4. ممثل outcoلي من جزئي الجذعية الاجتثاث الخلية بعد التشعيع جزئي. الجامعة جبل تهجين موضعية (الرغبة) للخلية الجذعية علامة Smed PIWI-1-يكشف عن أن المستورقات نوع البرية والخلايا الجذعية وزعت في جميع أنحاء أجسامهم باستثناء النسيج الأمامي لل المستقبلات الضوئية (رأس السهم) والبلعوم السليم ¹⁴ (النجمة). (أ) الرغبة في Smed-PIWI-1 في السيطرة المشع لكن محمية تماما ثابتة المستورقات ثلاثة أيام بعد التشعيع يظهر توزيع الخلايا الجذعية التي لا يمكن تمييزها عن تلك التي المستورقات النوع البري. (ب) من جهة أخرى، رغبة في Smed-PIWI-1 في الحيوانات التي تم جزئيا فقط محمية، وترك تتعرض الأمامية والخلفية، ولكن تم إصلاح أيضا ثلاثة أيام التالي يوضح التشعيع التي ذاب الخلايا الجذعية من مناطق غير محمية . الحانات هي مقياس 500 ميكرون.

الشكل 5. إكساءmples من زرع أنسجة الناجحة وغير الناجحة. (A) لايف صورا لوجهات النظر ظهري وبطني من مستورقة زرعها بنجاح ثلاثة أيام بعد الزرع. الكسب غير المشروع (المشار إليها) هي واضحة للعيان على كل السطوح ظهري وبطني وتحيط مع النسيج unpigmented المميزة في واجهة الطعم المضيف. (ب) في المقابل، لا زرع ناجحة عرض الأنسجة الكسب غير المشروع واضحة في موقع الزرع (المشار إليها)، وعرض بدلا من ذلك، unpigmented تلتئم، وجرح الجانبي من زرع فشلت. ويمكن للفساد أن تلتزم ظهري فقط أو على السطح البطني تشبه زرع ناجحة (أ) عندما ينظر اليها من جانب واحد، وزرع ناجحة (ب) عندما ينظر إليها من جهة أخرى. (ج) عندما يتم المطعمة البرية نوع (وزن) الأنسجة إلى مضيف المشع الذي ذاب من الخلايا الجذعية المقيمين والخلايا الجذعية المزروعة يتم الكشف في وقت لاحق من قبل الرغبة في اليومين Smed-PIWI-1 بعد الزرع،يتم عرض واضح لنجاح عمليات الزرع من خلال وجود محدد من الخلايا الجذعية فقط في أو حول موقع الكسب غير المشروع (النصال). الحانات هي مقياس 500 ميكرون.

Discussion

أهمية من الشلل

الشلل هو الى حد بعيد الخطوة الأكثر أهمية لإنجاز أي من هذه العمليات. إذا ثبتوا بشكل غير صحيح المستورقات قبل التشعيع جزئي، فإنها قد تحرك تحت درع الرصاص، وتسفر عن نتائج غير متسقة والتباس. وبالإضافة إلى ذلك، إذا لم يجمد ك...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
الغرض العام للنقل الماصة	سامكو	691
الشعرية أنابيب (ID 0.75 ملم)	FHC	30-30-0
الشعرية أنابيب (OD 0.7 مم)	FHC	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34155	VWR	500029-891
مرشح ورقة سوداء	شلايشر وSchuell	10310809
Whatman ورقة مرشح # 2 1002-055	فيشر العلمية	09-810B
Whatman ورقة مرشح # 3 1003-185	فيشر العلمية	09-820E
ورق السجائر المتداول	التعرج، الأصلي	NA
بيتريأطباق	VWR	82050-544
ملقط دومون، INOX # 5	FST	11251-20
Chloretone	سيجما ألدريتش	112054
الكازين	سيجما ألدريتش	C3400
يؤدي شيلدز	ألفا أنظمة كورب، Bluffdale، UT	تصميم حسب الطلب
XRAD-320 Irradiator البيولوجي	دقة الأشعة السينية، شمال برانفورد، CT	NA