تنقية من الفجوات المرضي من<em&gt; البكتيريا</em&gt; المصابة البالعات

Summary

توضح هذه المقالة طريقة لعزل وتنقية سليمة البكتيريا التي تحتوي على فجوات (LCVs) من الاميبا والضامة. البروتوكول على مرحلتين تشمل تخصيب LCV بواسطة المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام الأجسام المضادة ضد علامة LCV البكتيرية وتنقية المزيد من الطرد المركزي المتدرج الكثافة.

Abstract

والانتهازية الممرض الفيلقية المستروحة هو جرثومة الاميبا المقاوم، والذي يتطابق أيضا في الضامة السنخية وبذلك يكون الالتهاب الرئوي "داء الفيالقة" ^(1). في البالعات الأوالي والثدييات، L. بنوموفيلا توظف آلية الحفظ على تشكيل معين، والنسخ، متساهل مقصورة، و "البكتيريا التي تحتوي على فجوة" (LCV). LCV تشكيل يتطلب البكتيرية ICM / نقطة إفراز الرابع نوع النظام (T4SS)، والتي translocates ما يصل الى 275 "المستجيب" البروتينات في الخلايا المضيفة. والمستجيبات التلاعب البروتينات المضيفة، وكذلك نسبة الدهون والتواصل مع إفرازي، العضيات endosomal والميتوكوندريا ^2-4.

تشكيل LCVs يمثل عملية معقدة وقوية وزائدة عن الحاجة، والتي من الصعب فهم بطريقة اختزالية. مطلوب نهج تكاملي لفهم شامل تشكيل LCV، بما في ذلك تحليل عالمي للمسارالتفاعلات عامل ogen في استضافة وديناميتها الزمانية والمكانية. وذلك كخطوة أولى نحو تحقيق هذا الهدف، وتنقيته LCVs سليمة وتحليلها بواسطة البروتيوميات وlipidomics.

وقد تم التحقيق في تكوين وتشكيل الممرض المحتوية على فجوات بواسطة تحليل البروتين باستخدام اللوني السائل أو 2 مد هلام الكهربائي بالإضافة إلى مطياف الكتلة. آوى فجوات معزولة عن إما discoideum التربة الاجتماعية Dictyostelium الأميبا أو البالعات الثدييات الليشمانيا ^{5، 6} الليستيريا، المتفطرة ^7، Rhodococcus ^{8، 9} أو السالمونيلا النيابة البكتيريا. ^10. ومع ذلك، فإن البروتوكولات المستخدمة في تنقية هذه الدراسات وقتا طويلا ومملا، لأنها تتطلب على سبيل المثال المجهر الإلكتروني لتحليل LCV مورفولوجيا والنزاهة والطهارة. بالإضافة إلى ذلك، هذه البروتوكولات لا استغلال الميزات الخاصة للفجوة الممرض لENrichment.

الطريقة المعروضة هنا يتغلب على هذه القيود من خلال توظيف دال discoideum المنتجة للعلامة LCV الفلورسنت وذلك عن طريق استهداف البكتيرية صدق بروتين المستجيب، الذي انتقائي المراسي لغشاء LCV عن طريق الربط بين فوسفتيدلينوستول 4-الفوسفات (PtdIns (4) P) ^3،11. يتم إثراء LCVs في خطوة أولى من قبل المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام جسم مضاد الانجذاب-تنقية الابتدائية ضد صدق والأجسام المضادة الثانوية بالإضافة إلى حبات المغناطيسي، ثم في مرحلة ثانية من قبل الطرد المركزي Histodenz الكلاسيكية التدرج الكثافة ^12،13 (الشكل 1) .

دراسة بروتيوم من LCVs المعزولة من د. وكشفت discoideum أكثر من 560 بروتينات الخلية المضيفة، بما في ذلك البروتينات المرتبطة الحويصلات البلعمية، الميتوكوندريا، وأوروبا وجولجي، وكذلك GTPases عدة، والتي لم تكن قد تورطت في تشكيل LCV قبل ^13. LCVs التخصيب وتنقيته معحدد بروتوكول هنا يمكن تحليل مزيد من الفحص المجهري (المناعي، المجهر الإلكتروني)، طرق كيميائية حيوية (الغربية وصمة عار) والنهج البروتين أو lipidomic.

Protocol

1. الاستعدادات لعزل LCV

1. مسحة من البكتيريا المنتجة للبنوموفيلا DsRed اكسبريس ^13،14 من أسهم الجلسرين على لوحات أجار CYE مع 5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول (CAM) قبل أربعة أيام العزلة LCV. احتضان هذه البكتيريا عند 37 درجة مئوية.
2. بذرة من 1 ⁷ 10 س د. discoideum المنتجة GFP-calnexin أو RAW264.7 الضامة الفئران في 75 سم ثقافة الأنسجة ² 1 قوارير عدوى قبل يوم. استخدم 10 مل HL5 المتوسطة مع 20 ميكروغرام / مل G418 لD. discoideum واحتضان والأميبات في 23 درجة مئوية. لRAW264.7 الضامة استخدام 10 مل RPMI 1640 متوسطة تستكمل مع FCS 10٪ (حرارة المعطل) والجلوتامين 1٪، وتنمو هذه الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2. تستخدم ثلاثة على الأقل 75 سم ² لكل القوارير العدوى والعينة (الحد الأدنى 6 × 10 ⁷ الخلايا).
3. تطعيم ثقافة بين عشية وضحاها مع L. بنوموفيلا من لوحة CYE. اخذت انبوب اختبار 15 مل مع 3 مل المتوسطة آيو 5 ميكروغرام / CAM مل. تطعيم مع 100 ميكرولتر من تعليق البكتيرية أن يؤديا إلى التطوير التنظيمي _{ل 600Nm} من 0.1. احتضان الثقافة بين عشية وضحاها على عجلة دوران فوق 37 درجة مئوية في ل21-22 ساعة.

2. LCV العزلة

1. تغيير وسيلة د. خلايا discoideum لإزالة المضادات الحيوية، التي من شأنها أن تتداخل مع عدوى التالية.
2. قياس القطر الخارجي للثقافة بين عشية وضحاها. وينبغي أن البكتيريا قد وصلت العدوى ذروتها في 1 _{ل 600Nm} OD من ≥ 3، والتي تتطابق مع بكتيريا × 10 ⁹ 2 / مل.
3. يصيب الخلايا من خلال إضافة ما يقرب من 500 ميكرولتر من L. بنوموفيلا ثقافة بين عشية وضحاها إلى الخلايا المتنامية في 10 متوسطة HL5 مل (د discoideum) أو 10 مل RPMI 1640 (الضامة). وهذا يتوافق مع عدد وافر من العدوى (وزارة الداخلية) 50. بعد ذلك، تتم مزامنة العدوى عن طريق الطرد المركزي من البكتيريا على الخلايا في ز × 500 لمدة 10 دقيقة. ويتبع الطرد المركزيمن قبل حضانة D. discoideum الخلايا في درجة مئوية (25) والضامة RAW264.7 عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2، على التوالي. الوقت عدوى من 1 ساعة وتشمل الخطوة الطرد المركزي.
4. بعد الإصابة إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مرة واحدة لإزالة البكتيريا خارج الخلية. استخدام الثلج الباردة العازلة SorC عن د. discoideum والجليد الباردة في برنامج تلفزيوني عن RAW264.7 الضامة. أضف 3 مل HS العازلة، على أن تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني (روش) على كل قارورة وجمع الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. تجمع العينات المطابقة في أنبوب اختبار 15 مليلتر.
5. لتجانس العينة استخدام المحاقن مل 3 Luer لوك البلاستيك والفولاذ المقاوم للصدأ الخالط الكرة. تأكد من أن تعمل على الجليد. قبل أن تبدأ، وغسل الخالط الكرة مع الماء المقطر، لتجنب أي تلوث المنظفات والاحمرار مع عازلة الجليد HS الباردة للتخلص من فقاعات الهواء. استخدام تخليص الكرة 8 ميكرون.
6. شغل أول 3 مل في اوند حقنة تركيبها على الالخالط ه. اضغط على عينة ذهابا وإيابا تسع مرات خلال الخالط. تبادل المحاقن بعد ذلك لتجنب التلوث بمادة لا تهدف المتجانس. جمع وتجميع عينة متجانسة في أنبوب اختبار 15 مليلتر وأخذ عينة للتحليل 150 ميكروليتر المجهرية. قبل الشروع في عينة مختلفة تفكيك وغسل الخالط الكرة.
7. منع جناسة مع CS 2٪ أو FCS لمدة 30 دقيقة على شاكر على الجليد أو على عجلة فوق الغزل (10-20 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية.
8. بعد حظر استخدام جسم مضاد الانجذاب-تنقية الابتدائية ضد صدق (تخفيف 1:3000) أو ضد أي علامة البكتيرية الأخرى ملزم حصرا للغشاء LCV. دوامة الحل الضد قبل إضافته إلى جناسة. احتضان العينة لمدة 1 ساعة على شاكر على الجليد أو على عجلة فوق الغزل (10-20 دورة في الدقيقة) في 4 درجة مئوية.
9. في غضون ذلك، وإعداد التدرج Histodenz. استخدام أنبوب الاختبار 15 مليلتر لكل التدرج وثلاث 75 سم ² قوارير من عينة واحدة. خشب التنوبش، إضافة 5.75 مل من Histodenz 35٪ إلى أنبوب، والثانية، إضافة بعناية 5.75 مل من محلول Histodenz 10٪ على أعلى. بعد ذلك وضع بعناية في أنابيب أسفل أفقيا لمدة 1 ساعة.
10. بعد حضانة جناسة مع كاشف الحجب والأجسام المضادة الأولية، وأجهزة الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير عينة. تجاهل طاف وresuspend على بيليه في 1.5 مل HS العازلة. نقل العينات إلى أنبوب اختبار جديد 15 مل وأخذ عينة للتحليل 40 ميكرولتر المجهرية في وقت لاحق.
11. احتضان وبيليه مع الجسم المضاد الثانوي - في 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة على شاكر - MACS الماعز المضادة للأرنب مفتش الخرز الصغير (تخفيف 1:25) في غضون ذلك، وضع الأعمدة على حامل MACS المغناطيسية وتتوازن لهم 0.5 مل HS العازلة.
12. في وقت لاحق، وتطبيق العينات إلى العمود. جمع 150 ميكرولتر من التدفق من خلال لتحليل مجهري لاحق. غسل العمود ثلاث مرات مع 0،5 العازلة HS مل.
13. إزالة الأعمدة من تيهو المغناطيس وشطافة في LCVs مع 0،5 العازلة HS مل من التدفق على الفور. أخذ عينة 20 ميكرولتر لتحليل مجهري. ومن المتوقع أن الخطوة تنقية بواسطة المناعية المغناطيسي فصل الاستسلام لكل 1 × 10 ⁷ المصابين د. خلايا discoideum حوالي 1 × 10 ⁶ LCVs سليمة، والتي أثرت عن سبع مرات في شطافة مقارنة مع ¹³ التدفق من خلال.
14. وضع أنابيب التدرج Histodenz العودة إلى الوضع العمودي وتحميل بعناية شطافة على القمة. منبذة الأنابيب في غرام × 3350 لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
15. بعد الطرد المركزي أخذ 1.5 مل الكسور بدءا من الجزء السفلي من أنبوب الاختبار باستخدام طويل زجاج ماصة باستير. جمع تماما 8 أجزاء، كل من الجزء السفلي من أنبوب. لم يلاحظ أي الطبقات المرئية في الانحدار Histodenz المستمر. ومن المتوقع عادة على أعلى عائد من LCVs في جزء 4 في نسبة ~ 2 × 10 ⁵ LCVs سليمة في 1 × 10 ⁷ فيfected الأميبات ^13. كميات صغيرة من LCVs موجودة أيضا في أجزاء 3 و 5 على التوالي. وهكذا، فإن العائد الإجمالي للLCVs المنقى هو ~ 1 × 10 ⁶ LCVs سليمة في 6 × 10 ⁷ المصابين د. خلايا discoideum ^13. لا يمكن أن يؤديها انتعاش LCVs في درجة حرارة الغرفة (RT)، وLCVs تبدو مستقرة لعدة ساعات.

3. المجهرية تحليل العينات التي تم جمعها

1. إعداد 24 كذلك زراعة الأنسجة مسطحة القاع مع لوحة بولي-L-يسين coverslips المغلفة.
2. ماصة كل عينة التي اتخذت خلال تنقية LCV بالإضافة إلى 150 ميكرولتر من كل جزء كثافة التدرج في لوحة 24-جيدا. إضافة 0.5 مل العازلة HS إلى كل بئر لتخفيف تركيز Histodenz عالية. بعد ذلك، لوحة أجهزة الطرد المركزي في ز × 600 لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة بعناية وطاف وتحديد العينات مع بارافورمالدهيد 4٪ (منهاج العمل) لمدة 20 دقيقة في RT. بعد تثبيت غسل العينات مرتين. لناه SorC عن د. discoideum وبرنامج تلفزيوني لمدة RAW264.7 الضامة.
3. 1. تحميل عينات من GFP-calnexin تعبير د. discoideum، التي اتخذت في خطوات مختلفة خلال العزلة LCV، مباشرة على شرائح من الزجاج باستخدام Vectashield على سبيل المثال.
   2. احتضان عينات من RAW264.7 الضامة، التي اتخذت في خطوات مختلفة خلال العزلة LCV، مع حل حجب (1٪ في جيش صرب البوسنة PBS) لمدة 10 دقيقة في RT. استخدام أجسام مضادة لمكافحة صدق الأولية إلى وصمة عار في LCVs واحتضان ل1H في غرفة رطبة في RT (تقارب-المطهرون أرنب المضادة للصدق، 1:1000 في عرقلة عازلة). في وقت لاحق، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال المضادة للأرنب Cy5؛ 1:200 في عرقلة الحل) لمدة 30 دقيقة في غرفة رطبة ومظلمة في RT. أخيرا، وغسل العينات ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني ويشن منها على شرائح من الزجاج باستخدام Vectashield على سبيل المثال.
4. مورفولوجيا والنزاهة وكمية من LCVs معزولة عن GFP-calnexin تعبير د. ديسويتم تحليل coideum أو من RAW264.7 الضامة بواسطة المجهر مضان مجهزة مرشحات كافية.

4. ممثل النتائج

ويمكن متابعة نوعية وانتاجية وتنقية LCV بواسطة المناعية تقارب الفصل والطرد المركزي المتدرج الكثافة من قبل مضان المجهري (الشكل 1). لمحة عامة عن العينات التي تم جمعها خلال العزلة LCV من د. ويرد discoideu متر أو الضامة (الشكل 2). وجناسة من L. بنوموفيلا المصابين البالعات يظهر LCVs سليمة، ولكن أيضا الكثير من الحطام الخلية والبكتيريا خارج الخلية. بعد التكوير العينة، وكانت الصورة مماثلة لجناسة، وأحيانا أكثر كثافة قليلا. منذ LCVs سليمة يجب ان يلتزم العمود، والتدفق من خلال معظمها يحتوي على بكتيريا خارج الخلية والحطام الخلية. بعد يبلغ حجمه على عينة من العمود، ويحتوي على شطافة LCVs سليمة في كميات كبيرة. في أيدينا، وLCV purificati على ما يبدو أكثر فعالية لد. discoideum من لالضامة. في D. discoideum للفجوات الممرض تظهر مستدير والعائد من LCVs معزولة أكثر من 10 أضعاف مقارنة مع الضامة (الشكل 3). في البلدان ذات الاستهلاك المنخفض الضامة سليمة ملطخة الأجسام المضادة المختلفة تظهر أيضا أكثر غير منتظمة الشكل.

نظرة عامة على الشكل التخطيطي 1. من العزلة LCV. أ) عزل LCVs بواسطة المناعية المغناطيسي الفصل باستخدام جسم مضاد الانجذاب-تنقية ضد بروتين صدق المستجيب البكتيرية، وإضفاء الطابع المحلي على وجه الحصر لغشاء LCV. وتستخدم MACS الثانوية الدقيقة حبة الديناميكي الأجسام المضادة والمغناطيس 1 لعزل LCVs من حطام خلية. ب) بعد LCVs فصل المناعة المغناطيسي وتنقيته مزيد من كثافة Histodenz الطرد المركزي المتدرج. يتم إثراء LCVs في جزء 4.

upload/4118/4118fig2.jpg "/>
الشكل 2. العينات التي تم جمعها خلال تنقية LCV. صور من جناسة، بيليه، التدفق من خلال وشطافة من د. وصفت discoideum أو الضامة. هذه العينات تبين L. بنوموفيلا المنتجة DsRed اكسبريس (الحمراء) في د. discoideum المنتجة GFP-calnexin إشارة (أخضر، لوحة العليا) أو في الضامة ملطخة جسم مضاد لمكافحة صدق (سماوي، اللوحة السفلى). الحانات، و 10 ميكرون.

الشكل 3. تنقية LCVs من د. discoideum أو الضامة. هذه العينات تبين جزء 4 بعد كثافة Histodenz الطرد المركزي المتدرج من L. بنوموفيلا المنتجة DsRed اكسبريس (الأحمر) في (أ) د. discoideum المنتجة GFP-calnexin إشارة (الخضراء) أو (B). في الضامة ملطخة جسم مضاد لمكافحة صدق (السماوي) الحانات، و 10 ميكرون.

Discussion

وعلى النقيض من الأساليب المنشورة سابقا، ويستند هذا البروتوكول على خطوتين، لأول مرة فصل LCVs بواسطة نهج المناعية المغناطيسي، والثانية، وتنقية من LCVs بواسطة الطرد المركزي المتدرج الكثافة. ويمكن عزل LCV اتباعها بسهولة بواسطة المجهر مضان، عندما يتم استخدام أي من البكتيريا...