La purificación del patógeno a partir de vacuolas<em&gt; Legionella</em&gt; Infectados por fagocitos

Resumen

Este artículo describe un método para el aislamiento y purificación de intacta Legionella Que contienen vacuolas (LCV) de amebas y los macrófagos. El protocolo de dos pasos comprende enriquecimiento LCV por inmuno-separación magnética usando un anticuerpo contra un marcador bacteriano LCV y purificación adicional por centrifugación en gradiente de densidad.

Resumen

El patógeno oportunista Legionella pneumophila es una bacteria resistente a la ameba, que también se replica en los macrófagos alveolares por lo tanto causantes de la neumonía grave "Enfermedad de los Legionarios" ^1. En los fagocitos protozoos y mamíferos, L. pneumophila emplea un mecanismo conservado para formar un procedimiento específico, la replicación permisiva del compartimiento, la "Legionella contiene vacuola" (LCV). La formación de vehículos comerciales requiere la bacteria icm / Dot sistema de secreción tipo IV (T4SS), que se transloca hasta 275 "efector" proteínas en las células huésped. Los efectores manipulan proteínas del huésped, así como los lípidos y comunicarse con secreción, organelos endosomal mitocondrial y ^2-4.

La formación de los LCV representa un proceso complejo, robusto y redundante, lo que es difícil de entender de una manera reduccionista. Un enfoque integral es necesaria para comprender globalmente la formación de vehículos comerciales ligeros, incluyendo un análisis global de la trayectoriaacogida ogen las interacciones de los factores y su dinámica temporal y espacial. Como un primer paso hacia esta meta, vehículos comerciales intactas son purificados y analizados por la proteómica y la lipidómica.

La composición y la formación de agentes patógenos que contienen vacuolas ha sido investigado por el análisis proteómico mediante cromatografía líquida o 2-D electroforesis en gel acoplado a espectrometría de masas. Vacuolas aisladas, ya sea del suelo de la sociedad ameba Dictyostelium discoideum, o los fagocitos de mamíferos albergaba Leishmania ^5, Listeria ^{6, 7} Mycobacterium, Rhodococcus ^{8, 9} o Salmonella spp Legionella. ^10. Sin embargo, los protocolos de purificación empleadas en estos estudios son mucho tiempo y tedioso, ya que requieren microscopía electrónica por ejemplo, para analizar la morfología LCV, la integridad y la pureza. Además, estos protocolos no explotar las características específicas de la vacuola es patógeno pararichment.

El método que aquí se presenta supera estas limitaciones mediante el empleo de D. discoideum produciendo un marcador fluorescente de vehículos comerciales ligeros y por la orientación de la SIDC bacteriana proteína efectora, que selectivamente ancla a la membrana de vehículos comerciales ligeros de la unión a fosfatidilinositol 4-fosfato (PtdIns (4) P) ^3,11. LCV están enriquecidos en un primer paso por inmuno-separación magnética usando un anticuerpo purificado por afinidad primaria contra SIDC y un anticuerpo secundario acoplado a perlas magnéticas, seguido en un segundo paso por una centrifugación en gradiente de densidad clásica Histodenz ^12,13 (fig. 1) .

Un estudio del proteoma de vehículos comerciales aislados de D. discoideum reveló más de 560 proteínas de la célula huésped, incluidas las proteínas asociadas a vesículas fagocíticas, ER mitocondrias y aparato de Golgi, así como las GTPasas varios que no han sido implicados en la formación antes del ^{13 de} LCV. LCV enriquecido y purificado con elprotocolo descrito aquí pueden ser analizadas por microscopía (inmunofluorescencia, microscopía electrónica), los métodos bioquímicos (Western blot) y los enfoques proteómicos o lipidomic.

Protocolo

1. Los preparativos para el Aislamiento de LCV

1. Streak a Legionella pneumophila produce DsRed-Express ^13,14 de las existencias de glicerol en placas de agar CYE con 5 mg / ml de cloranfenicol (Cam) cuatro días antes del aislamiento LCV. Incubar las bacterias a 37 ° C.
2. Semillas de 1 x 10 ⁷ D. discoideum la producción de GFP-calnexina o RAW264.7 macrófagos murinos en cultivo 75 cm ² frascos de un tejido de la infección antes de los días. Utilizar 10 ml HL5 medio con 20 mg / ml de G418 para D. discoideum e incubar las amebas a 23 ° C. Para RAW264.7 macrófagos utilizar 10 ml de medio RPMI 1640 suplementado con 10% de FCS (inactivado por calor) y 1% de glutamina, y cultivar las células a 37 ° C y 5% de CO _2. Use al menos tres 75 cm ² frascos por la infección y de la muestra (un mínimo de 6 x 10 ⁷ células).
3. Inocular un cultivo de una noche con L. pneumophila de la placa de CYE. Tomar un tubo de ensayo de 15 ml con 3 ml de medio de la EJAy 5 ug / ml de leva. Se inoculan con 100 l de una suspensión bacteriana para producir una _600nm OD de 0,1. Incubar el cultivo durante la noche en una rotación de la rueda de arriba a 37 ° C durante 21-22 horas.

2. LCV aislamiento

1. Cambiar el medio de la D. células discoideum para eliminar el antibiótico, que podría interferir con la infección siguiente.
2. Mida el diámetro exterior de la cultura durante la noche. Las bacterias se han alcanzado su infectividad pico a _{600 nm} un diámetro exterior de ≥ 3, que corresponde a 2 x 10 ⁹ bacterias por ml.
3. Infectar las células mediante la adición de aproximadamente 500 l de la L. pneumophila noche a la mañana la cultura a las células que crecen en 10 ml HL5 medio (D. discoideum) o 10 ml de RPMI 1640 (macrófagos). Esto corresponde a una multiplicidad de infección (MOI) de 50. Posteriormente, la infección está sincronizado por centrifugación de las bacterias sobre las células a 500 xg durante 10 min. La centrifugación se siguiópor una incubación de la D. células discoideum a 25 ° C y los macrófagos RAW264.7 a 37 ° C y 5% de CO _2, respectivamente. El tiempo de infección de 1 hora incluye la etapa de centrifugación.
4. Después de la infección se elimina el medio y lavar las células una vez para eliminar las bacterias extracelulares. Use helado de amortiguación sorc para D. discoideum y helado de PBS para RAW264.7 macrófagos. Añadir 3 ml HS tampón, suplementado con inhibidores de la proteasa (Roche) a cada matraz y recoger las células mediante el uso de un raspador de células. Piscina de las muestras correspondientes en un tubo de ensayo de 15 ml.
5. Para la homogeneización de las muestras de uso de plástico de 3 ml jeringas Luer-Lock y la bola de acero inoxidable homogeneizador. Asegúrese de que usted trabaja en el hielo. Antes de comenzar, lave el homogenizador de la pelota con agua destilada, para evitar cualquier contaminación de detergente y enjuague con tampón enfriado con hielo SA para deshacerse de las burbujas de aire. Utilice la bola 8 micras de liquidación.
6. Rellena los primeros 3 ml en la jeringa und montarlo en ªe homogeneizador. Pulse la muestra de ida y vuelta nueve veces a través del homogeneizador. Intercambiar las jeringas después para evitar la contaminación con material no-homogéneo. Recoger y la piscina de la muestra homogeneizada en un tubo de ensayo de 15 mL y tomar una muestra de 150 l para el análisis microscópico. Antes de proceder con una muestra diferente desmontar y lavar el homogeneizador de pelota.
7. Bloque el homogeneizado con 2% de CS o FCS durante 30 minutos en un agitador en hielo o en una rueda de sobrecarga de hilatura (10-20 rpm) a 4 ° C.
8. Tras el bloqueo utiliza un anticuerpo purificado por afinidad primaria contra SIDC (dilución 1:3000) o contra cualquier otro marcador bacteriana exclusivamente la unión a la membrana de vehículos comerciales ligeros. Vortex el anticuerpo solución antes de añadirlo al homogeneizado. Incubar la muestra durante 1 hora en un agitador en hielo o en una rueda de sobrecarga de hilatura (10-20 rpm) a 4 ° C.
9. Mientras tanto, preparar el gradiente Histodenz. Utilizar un tubo de ensayo 15 ml por gradiente y tres 75 cm ² frascos de una muestra. Abetoc, añadir 5,75 ml de 35% Histodenz al tubo, y segundo, añadir cuidadosamente 5,75 ml de solución al 10% Histodenz en la parte superior. Luego coloque cuidadosamente los tubos en posición horizontal durante 1 hora.
10. Después de la incubación del homogeneizado con el reactivo de bloqueo y el anticuerpo primario, se centrifuga a 600 xg durante 15 min a 4 ° C para sedimentar la muestra. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1,5 ml de tampón HS. Transferir las muestras a un nuevo máximo de 15 ml tubo de ensayo y tomar una muestra de 40 l para el análisis microscópico más adelante.
11. Incubar la bolita con el anticuerpo secundario - MACS de cabra anti-conejo IgG microesferas (dilución 1:25) - durante 30 minutos en un agitador a 4 ° C. Mientras tanto, poner las columnas en el soporte magnético y MACS equilibre con 0,5 ml de tampón HS.
12. Posteriormente, se aplican las muestras a la columna. Recoger 150 l de el flujo a través de análisis microscópico posterior. Lavar la columna tres veces con 0,5 ml de tampón HS.
13. Eliminar las columnas de tél imán y eluido los vehículos comerciales con 0,5 ml de tampón HS inmediata de chorros. Tomar una muestra de 20 l para el análisis microscópico. La etapa de purificación por inmuno-separación magnética se espera que el rendimiento por 1 x 10 ⁷ infectado D. discoideum células de aproximadamente 1 × 10 ⁶ VCL intactos, que se enriquecen unas siete veces en el eluido en comparación con el flujo a través de ^13.
14. Colocar los tubos de gradiente Histodenz de nuevo a una posición vertical y con mucho cuidado la carga que el efluente en la parte superior. Centrifugar los tubos a 3350 × g durante 1 hora a 4 ° C.
15. Después de la centrifugación tomar 1,5 ml fracciones a partir de la parte inferior del tubo de ensayo mediante el uso de una pipeta Pasteur de vidrio larga. En conjunto recoger ocho fracciones, cada una desde la parte inferior del tubo. No hay capas visibles se observan en la continua pendiente Histodenz. El mayor rendimiento de LCV típicamente se espera en la fracción 4 en una proporción de 2 x 10 ~ ⁵ LCV intactos por 1 x 10 ⁷ eninfectado amebas ^13. Pequeñas cantidades de LCV también están presentes en las fracciones 3 y 5, respectivamente. Así, el rendimiento global de LCV purificadas es de ~ 1 x 10 ⁶ LCV intactas por 6 x 10 ⁷ infectado D. células discoideum ^13. La recuperación de vehículos comerciales se puede realizar a temperatura ambiente (TA), y los vehículos comerciales parecen estables durante varias horas.

3. El análisis microscópico de las muestras recogidas

1. Preparar un 24-así de fondo plano placa de cultivo de tejido con poli-L-lisina cubreobjetos revestidos.
2. Pipetear todas las muestras tomadas durante la purificación LCV más 150 l de cada fracción de gradiente de densidad en la placa de 24 pocillos. Añadir 0,5 ml de tampón HS a cada pocillo para diluir la alta concentración Histodenz. Después, centrifugar la placa a 600 xg durante 10 min a 4 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante y fijar las muestras con 4% paraformaldehído (PFA) durante 20 min a temperatura ambiente. Después de la fijación lavar las muestras dos veces. Nosotrose sorc para D. discoideum y PBS para RAW264.7 macrófagos.
3. 1. Montar las muestras de las buenas prácticas agrarias que expresan calnexina D. discoideum, tomadas en diferentes etapas durante el aislamiento vehículos comerciales ligeros, directamente en las diapositivas de cristal con Vectashield por ejemplo.
   2. Se incuban las muestras de RAW264.7 macrófagos, tomadas en diferentes etapas durante el aislamiento LCV, con solución de bloqueo (1% de BSA en PBS) durante 10 min a temperatura ambiente. Utilice un anticuerpo primario anti-SIDC para teñir los vehículos comerciales e incubar durante 1 hora en cámara húmeda a temperatura ambiente (purificado por afinidad de conejo anti-SIDC; 1:1000 en tampón de bloqueo). Posteriormente, lavar las muestras tres veces con PBS. Se incuba con un anticuerpo secundario (por ejemplo, anti-conejo Cy5; 1:200 en solución de bloqueo) durante 30 minutos en una cámara húmeda y oscuridad a temperatura ambiente. Por último, lavar las muestras tres veces con PBS y montarlos en las diapositivas de cristal con Vectashield por ejemplo.
4. Morfología, la integridad y la cantidad de los vehículos comerciales aisladas a partir de las buenas prácticas agrarias-que expresa calnexina D. descoideum o de RAW264.7 macrófagos son analizados por un microscopio de fluorescencia equipado con los filtros adecuados.

4. Los resultados representativos

La calidad y el rendimiento de la purificación LCV por inmuno-afinidad separación y centrifugación en gradiente de densidad puede ser seguido por microscopía de fluorescencia (Fig. 1). Una visión general de las muestras recogidas durante el aislamiento LCV de D. discoideu m o macrófagos se muestra (fig. 2). El homogeneizado de L. pneumophila infectados por los fagocitos muestra VCL intactas, sino también una gran cantidad de restos celulares y bacterias extracelulares. Después de la granulación de la muestra, la imagen es similar al homogeneizado, a veces un poco más denso. Desde LCV intactas debe pegarse a la columna, el flujo a través contiene principalmente bacterias extracelulares y residuos celulares. Después de eluir la muestra de la columna, el eluido contiene LCV intactos en grandes cantidades. En nuestras manos, el Purificati LCV en que parece ser más eficaz para D. discoideum que para los macrófagos. En D. discoideum las vacuolas patógenos aparecen más redondo y el rendimiento de LCV aisladas es más de 10 veces mayor en comparación con los macrófagos (Fig. 3). En los macrófagos intactos bajo consumo teñidas con diferentes anticuerpos también parecen tener más de forma irregular.

Figura 1. Esquema general de aislamiento de vehículos comerciales ligeros. A) Aislamiento de LCV por inmuno-separación magnética usando un anticuerpo purificado por afinidad contra la proteína efectora SIDC bacteriana, localizando exclusivamente a la membrana LCV. Un MACS secundaria micro talón acoplado anticuerpo y un imán se utilizan para aislar LCV de los restos celulares. B) Después de separación LCV inmuno-magnéticas se purifica adicionalmente por centrifugación Histodenz gradiente de densidad. VCL se enriquecen en la fracción 4.

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Las muestras Figura 2. Recogidos durante la purificación LCV. Imágenes de homogeneizado, pellet, el filtrado y eluido de D. discoideum o macrófagos se representan. Las muestras presentan L. pneumophila produce DsRed-Express (rojo) en el D. discoideum la producción de GFP-calnexina señal (panel verde, parte superior) o en los macrófagos teñidos con un anticuerpo anti-SIDC (cian, panel inferior). Bares, 10 m.

Figura 3. Purificada vehículos comerciales de D. discoideum o macrófagos. Las muestras presentan la fracción 4 después de la centrifugación Histodenz gradiente de densidad de L. pneumophila produce DsRed-Express (rojo) en (A) D. discoideum la producción de GFP-calnexina señal (verde) o (B) en los macrófagos teñidos con un anticuerpo anti-SIDC (cian). Bares, 10 m.

Discusión

En contraste con los métodos publicados anteriormente, este protocolo se basa en dos pasos, primero la separación de LCV por un enfoque inmuno-magnética, y en segundo lugar, la purificación de LCV por centrifugación en gradiente de densidad. El aislamiento LCV se pueden seguir fácilmente por microscopía de fluorescencia, cuando sea bacterias marcadas fluorescentemente y las células productoras de GFP o tinción de anticuerpos se utiliza. El protocolo se describe aquí es un sencillo, recto hacia adelante método...