قياس تأثيرات على الأجسام المضادة من وظيفة الخلوية Cardiomyocytes متفرقة

Lars G. Eckerle; Stephan B. Felix; Lars R. Herda

doi:10.3791/4237

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

طريقة عرض يوفر وسيلة للكشف عن الأجسام المضادة وظيفية فعالة cardiotropic في البلازما من المرضى الذين يعانون من تمدد عضلة القلب، بغض النظر عن مستضد محددة، من خلال تحليل أثر المناعي المريض معزولة على تقصير الخلوية والعابرين الكالسيوم داخل الخلايا في الفئران المعزولة cardiomyocytes.

Abstract

تمدد عضلة القلب (DCM) هي واحدة من الأسباب الرئيسية لفشل القلب في البالغين الأصغر سنا ^1. على الرغم من أن المعروف التصرف الوراثية والتعرض للمواد السامة الأسباب لهذا المرض في حوالي ثلث المرضى، وأصل DCM زال من غير الواضح إلى حد كبير. في عدد كبير من هؤلاء المرضى، فقد تم الكشف عن الأجسام المضادة ضد الحواتم القلب والتي يشتبه في أنها تلعب دورا محوريا في بداية وتطور المرض ^2،3. وشدد على أهمية الأجسام المضادة التي كتبها القلب تحسن الدورة الدموية لوحظ في المرضى DCM بعد القضاء على الأجسام المضادة من امتزاز مناعي ^3-5. مجموعة متنوعة من مستضدات محددة قد حددت بالفعل ^2،3 ويمكن الكشف عن الأجسام المضادة ضد هذه الأهداف بحلول المناعية. ومع ذلك، يمكن لهذه المقايسات لا تميز بين تحفيز (وبالتالي فعالة وظيفيا) ومنع الأجسام المضادة. هناك زيادة evidenم أن هذا التمييز هو ^6،7 حاسمة. ويمكن أيضا أن يفترض أن الأهداف لعدد من الأجسام المضادة لا تزال مجهولة cardiotropic وبالتالي لا يمكن الكشف عنها بواسطة المناعية. ولذلك، أنشأنا وسيلة للكشف عن الأجسام المضادة وظيفيا cardiotropic نشطة، مستقلة عن مستضد كل منهما. الخلفية للأسلوب هو التماثل عالية وعادة ما يلاحظ بالنسبة للمناطق الوظيفية للبروتينات القلب في الثدييات بين ^8،9. هذا يشير إلى أن الأجسام المضادة الموجهة ضد مستضدات القلب الإنسان ومع الخلايا المستهدفة غير البشرية، والذي يسمح اختبار مفتش الحكومة من المرضى DCM على cardiomyocytes الفئران الكبار عبور الرد. طريقتنا تتكون من 3 خطوات: أولا، يتم عزل مفتش من البلازما المريض باستخدام sepharose و يقترن المضادة للمفتش الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من أعمدة امتزاز مناعي (PlasmaSelect، Teterow، ألمانيا). يتم عزل الثاني، cardiomyocytes الكبار بحلول نضح كولاجيناز في جهاز نضح Langendorff باستخدام AProtocol تعديل من الأعمال السابقة ^10،11. وترد في الحصول على cardiomyocytes coverglasses حجرات laminin المغلفة وملطخة FURA-2، صبغة الفلورسنت الكالسيوم الانتقائية التي لا يمكن أن تتحقق بسهولة في الخلية داخل الخلايا لمراقبة الكالسيوم (كا ^{2 +)} محتويات ^12. في الخطوة الأخيرة، وأثر مفتش المريض على تقصير الخلايا والكالسيوم ^{2 +} يتم رصد العابرين من cardiomyocytes مجال حفز على الانترنت باستخدام خلية عضلية والكالسيوم التجارية انقباض نظام الرصد (IonOptix، ميلتون، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) متصلة الفلورسنت القياسية لمعكوس المجهر.

Protocol

1. مفتش عزل من عينات المرضى

إعداد ميني امتزاز مناعي عن طريق ملء الأعمدة 3 مل المضادة للمفتش sepharose و في 2 مل EDTA المريض البلازما في عمود فارغ باك فندق Econo. مفتش العزلة يتطلب على الأقل 2 مل من البلازما المريض.
وضع مرشح على رأس sepharose و المضادة للمفتش، وقطع فتح انخفاض غيض من العمود ثم اضغط على مرشح ليصل الى معدل تدفق ما يقرب من 1 قطرة / ثانية. اسمحوا الحل الحفاظ نفاد العمود.
غسل العمود مع 3 مجلدات 0.9٪ كلوريد الصوديوم في حجم البلازما.
ماصة البلازما على العمود. عندما البلازما ومغمورة تماما في sepharose و المضادة للمفتش، وغسل مع وحدة التخزين نفسها كلوريد الصوديوم 0.9٪.
ماصة حجم البلازما واحد من حمض الهيدروكلوريك 0.2 M جليكاين، ودرجة الحموضة 2.8 على العمود والسماح تزج في sepharose و. إضافة وحدة تخزين أخرى من حمض الهيدروكلوريك جليكاين على العمود. جمع من خلال تدفق في أنبوب 15 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع 0.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0.
لتجديد العمود، وغسل حمض الهيدروكلوريك مع 3 بلازما جليكاين مجلدات. بعد غسل النهائي مع 2 مجلدات 0.9٪ كلوريد الصوديوم، يمكن استخدام عمود للعينة البلازما المقبل. وبدلا من ذلك، يمكن ملء العمود مع الحفاظ الحل وتخزينها في 4 - 8 ° C لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
للاستخدام على cardiomyocytes، الكسر مفتش جمعها لابد من مدال ضد العازلة التجريبية (EB). لإعداد EB، إضافة كلوريد الصوديوم 117 ملم، 2.8 ملي بوكل، 0.6 ملم MgCl _2، 1.2 مم KH ₂ PO _4، 1.2 مم CaCl _2، HEPES 10 و 20 ملي ملي الجلوكوز في الماء المقطر L 1 على النمام المغناطيسي وضبط درجة الحموضة إلى 7.3.
ملء جزء مفتش لأنبوب استر السليلوز غشاء غسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع من 100 كيلو دالتون. وضع أنبوب في EB L 1 ويحرك ببطء مع النمام المغناطيسي عند 4 ° C. بعد 8 ساعات، نقل أنبوب غسيل الكلى في 3 L من EB الطازجة وdialyze لمدة ساعة 20 في 4 درجات مئوية.
بعد غسيل الكلى، والحرارة العينة لمدة 30 دقيقة عند 57 درجة مئوية في حمام مائي لinactivatعوامل مكملة ه. تحديد إجمالي مفتش التركيز وإعداد مأخوذة تحتوي على 330 ميكروغرام لكل مفتش. عند إضافة العينة لcardiomyocytes لقياس (الخطوة 4.3)، تملأ مأخوذة إلى 1 مل مع EB. ويمكن تخزين مأخوذة غير مخفف في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

2. عزل Cardiomyocytes الجرذ

لإعداد كا ^{2 +} خالية من العزلة عازلة (IB)، إضافة 110 مم كلوريد الصوديوم، 2.6 ملي بوكل، 1.2 ملي MgSO _4، 1.2 مم KH ₂ PO _4، HEPES 20 ملي مول و 11 ملم إلى الجلوكوز المياه L 1 المقطر باستخدام المغناطيسي النمام. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 في درجة حرارة الغرفة وفلتر من خلال مرشح ميكرون 0،2 الأعلى للزجاجة التعقيم.
ملء 80 مل من IB في الخزان العلوي من نظام Langendorff نضح thermostated. ضبط إعدادات الحرارة للحفاظ على درجة الحرارة عازلة للC ° 37 وتهوية العازلة مع O٪ 95 _2/5٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة.
تزن ما يقرب من 10،000 - 12،000 من U collagenase نوع II، 175 ملغ حمض الدهنية الحرة وحل BSA في 20 مل تحتوي على 22،5 IB ميكرولتر من حل من 100 ملي CaCl الأسهم _2. السيطرة على درجة الحموضة عازلة للعزلة في الخزان العلوي وتعديل إذا لزم الأمر.
تخدير الفئران ويستار من 175 حتي 200 غ مع 375 ميكروغرام / كغ وزن الجسم ثيوبنتال. إضافة إلى 2500 وحدة دولية الهيبارين حل ثيوبنتال. بعد بضع الصدر والقلب والمكوس بعناية مع قوس الأبهر سليمة وتحويلها إلى ثلج الباردة كلوريد الصوديوم 0.9٪. تنظيف القلب من الدم والأنسجة المحيطة بها ونقلها لكلوريد الصوديوم النقي بنسبة 0.9٪. فضح الشريان الأورطي، فتح المخفض تدفق النظام Langendorff للحصول على سرعة إسقاط 2-3/sec وإرفاق القلب إلى قنية.
يروي قلب لمدة تصل إلى 3 دقائق مع معدل التدفق من 1 قطرة / ثانية لتغسل الدم المتبقية. بدء تعميم IB في النظام Langendorff. إزالة 20 مل العازلة من الخزان العلوي، وملء في حل كولاجيناز والملء وحاجز بكثير كما هو مطلوب ليصل إلى 80 ملم. تعميم ج حل آخر لollagenase دقيقة 27. يجب السيطرة على معدل التدفق بشكل دوري والحفاظ عليها في 1 قطرة / ثانية باستخدام المخفض التدفق.
فصل القلب من قنية ونظيفة من الأذينين والشريان الأورطي وختم الى قطع صغيرة. يسمح الحل كولاجيناز لتشغيل في أقل الخزان، والحد من حجم إلى حد أقصى قدره 40 مل وهضم المزيد من البطينين المفروم لمدة 10 - 15 دقيقة تحت تهوية مستمرة مع 95٪ O _2/5٪ CO _2. بعد ذلك، تصفية التعليق الخلية من خلال الشاش ميكرومتر 200 حجم فتحات الشباك في أنبوب 50 مل.
استعادة محتوى الكالسيوم ^{+ 2} من الخلايا في 3 خطوات: أجهزة الطرد المركزي لتعليق الخلية في 43 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والخلايا resuspend في IB 10 مل تحتوي على 200 ميكرومتر CaCl _2. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى و resuspend الخلايا في IB 10 مل مع 500 ميكرومتر CaCl _2. بعد إعادة تعليق على الطرد المركزي في النهائي cardiomyocytes العقيمة EB تصفيتها (انظر 1.8) إلى كثافة من 50،000 خلية / مل.

e_title "> 3. FURA-2 تلوين من Cardiomyocytes

معطف ساترة 4 غرف بشكل جيد مع laminin ميكروغرام 10 في جيدا والانتظار حتى يتم تجفيفها بالكامل.
ملء 1 مل من تعليق cardiomyocyte في كل بئر باستخدام micropipette مع طرف قطع. السماح للخلايا الالتزام ل1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
تمييع 10 ميكرولتر من 1 ملغ / مل FURA-02:00 محلول المخزون في EB 5 مل. الحفاظ على حل تلطيخ في الظلام.
خلع العازلة وغير مرتبط الخلايا من ساترة وماصة 0.5 مل من محلول التلوين في كل جانب. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة تحت الهز معتدلة. وبعد ذلك، خلع حل تلطيخ، وغسل الخلايا مرة واحدة مع EB 1 مل وأخيرا 0،5 ملء EB مل في كل بئر. تجنب الضوء المباشر أثناء عملية التلوين والحفاظ على الخلايا الملون دائما في الظلام.

4. تسجيل تقصير الخليوي والكالسيوم ^{2 +} العابرين

وضع ساترة على حجرات م مضان عكسيةicroscope متصلة الكالسيوم خلية عضلية وانقباض نظام التسجيل. وضع قطب كهربائي العرف مع تدفق وأنبوب هروب رأس المال في أول بئر. Superfuse cardiomyocytes مع EB مل / دقيقة 1 و بدء التحفيز الكهربائي (20 V، 1 هرتز و 5 ميللي ثانية مدتها). السماح للخلايا للتكيف مع التحفيز لحوالي 2 دقيقة.
اختيار cardiomyocyte قضيب على شكل سليمة مع تثليم واضحة وانكماش مستمر. وضع الخلية في وسط الميدان البصرية وفتح قناة الكاميرا. توجيه الخلية أفقيا داخل منطقة الفيديو عن طريق تناوب محول تأطير الخلية وتحريك المرحلة المجهر.
ضبط حافة الكشف عن عناصر السيطرة على المنطقة الفيديو (الشكل 2)، فتح قناة الفلورسنت وسجل 10 حتي 15 تقلصات للحصول على تقصير الخلية الأولي والكالسيوم ^{2 +} عابرة.
إغلاق قناة ضوء المجهر لتجنب وصمة عار تبييض مضان. التبديل تدفق من خلال من EB إلى عينةتجاوز مع صمام الطريق و3-cardiomyocytes superfuse مع 1 مل من مفتش المريض. وقف ضخ الهواء إلى قبل البئر.
فتح قناة الخفيفة وتسجيل آخر 10 حتي 15 تقلصات للحصول على استجابة الخلية الحادة. تسجيل وقفة إغلاق القناة الضوء مرة اخرى. تكرار التسجيل بعد 5 دقائق (2) و.
إخراج الكهربائي للبئر. تنظيف أنابيب تماما مع EB ومتابعة البئر القادمة للحجرات ساترة.
تحليل الخلايا وتقصير كا ^{2 +} عابرة مع البرنامج IonWizard باستخدام "Edge-Length/Length" و "FURA 2-الرقمي طرح / نسبة" نافذة، على التوالي. حساب التغير في المئة من الخلايا الأولية وتقصير كا ^{2 +} عابرة للارتفاع القمة المشار إليها خط الأساس (BL٪ الذروة ح) لالحادة، وحد أدنى 2 والرد 5 دقائق.