İzole kardiyomiyositlerin Hücresel Fonksiyon üzerine Antikor Etkilerinin Ölçümü

Lars G. Eckerle; Stephan B. Felix; Lars R. Herda

doi:10.3791/4237

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sunulan yöntem izole sıçan kardiyomiyositlerde hücresel kısalma ve hücre içi kalsiyum geçici üzerinde izole hasta immunglobulin etkisini analiz ederek, bağımsız spesifik antijen, dilate kardiyomiyopatili hastaların plazmasında fonksiyonel etkin cardiotropic otoantikor saptamak için bir yol sunar.

Özet

Dilate kardiyomiyopati (DKMP) genç yetişkinler ¹ kalp yetmezliği için ana nedenlerinden biridir. Toksik maddelere genetik eğilim ve fuar hastaların yaklaşık üçte birinde bu hastalığın nedenleri bilinmesine rağmen, DCM kökeni büyük ölçüde belirsizdir. Bu hastaların önemli bir kısmında, kardiyak epitoplara otoantikorların tespit edilmiş ve hastalığın ^2,3 başlangıcı ve ilerlemesinde önemli bir rol oynadığından şüphe edilir. Kardiyak otoantikorların önemi immunoadsorbsiyon ^3-5 ile otoantikorların ortadan kaldırıldıktan sonra DCM hastada hemodinamik iyileşme altı çizilir. Spesifik antijenlerin çeşitli zaten ^2,3 tespit edilmiştir ve bu hedeflere karşı antikorlar immunoassay ile tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu ölçümlerin uyarıcı (ve bu nedenle de fonksiyonel olarak etkin) ile bloke edici antikorlar arasında ayırt edemez. Eviden vardır artmaktadırBu ayrım önemlidir ^6,7 olduğunu ce. Aynı zamanda, cardiotropic antikorların bir dizi hedeflerin yine tanımlanamayan ve bu nedenle bağışıklık deneyleri ile tespit edilemez olduğu kabul edilebilir. Bu nedenle, kendi antijeninin bağımsız işlevsel olarak aktif cardiotropic antikor tespiti için bir metod kurulmamıştır. Yöntem için arka plan genellikle memeli ^8,9 arasında kardiyak proteinlerin işlevsel bölgeleri için gözlenen yüksek bir homoloji olduğu. Bu insan antijenlerine karşı, kardiyak antikorlar erişkin sıçan kardiyomiyositler üzerine DCM hastaların IgG test veriyor insan olmayan hedef hücreleri, ile çapraz reaksiyona girer göstermektedir. Önerilen yöntem, 3 adımlardan oluşur: ilk olarak, IgG immunoadsorbsiyon sütunlar (PlasmaSelect, Teterow, Almanya) dan elde edilen Sepharose birleştirilmiş anti-IgG antikorları kullanılarak hasta plazmadan izole edilir. İkinci olarak, erişkin kardiyomiyositlerde ap kullanılarak bir Langendorff perfüzyon cihaz içinde kolajenaz perfüzyon yoluyla izole edilirotokol önceki eserlerinden ^10,11 güncellenmiştir. Elde edilen kardiyomiyositlerde laminin kaplanmış odacıklı coverglasses eklenmiş ve Fura-2, kolaylıkla (Ca ^{2 +)} içindekiler ¹² hücre içi kalsiyum gözlemlemek için hücre içine getirilebilir bir kalsiyum-seçici floresan boya ile boyanır. Son aşamada, hücre katı ve Ca ² hasta IgG etki ⁺ alan uyarılan kardiyomiyositlerde geçici bir standart ters floresan bağlı olan bir ticari miyosit kalsiyum ve kasılmasını kontrol sisteminin (IonOptix, Milton, MA, ABD) kullanılarak online olarak izlenir mikroskop.

Protokol

1. Hasta Örneklerden IgG İzolasyonu

Boş Econo Pac sütuna 2 ml hastanın EDTA plazma başına 3 ml anti-IgG Sepharose doldurarak mini immunoadsorbsiyon sütunlar hazırlayın. IgG izolasyon hastanın plazma, en az 2 ml gerektirir.
Anti-IgG Sepharose üstünde filtre yerleştirin, sütunun alt ucu açık kesilmiş ve yaklaşık olarak 1 damla / sn 'lik bir akış hızına ulaşmak için filtre düğmesine basın. Sütunun tükendi korunması çözümü olsun.
3 cilt plazma hacmi başına% 0.9 NaCl ile sütun yıkayın.
Sütun üzerinde plazma pipet. Plazma tamamen anti-IgG Sepharose batırılır sonra, aynı hacimde% 0.9 NaCl ile yıkanır.
Pipet bir plazma sütun üzerinde 0.2 M glisin HCl, pH 2.8 hacim ve Sepharose içine batırmayın edelim. Sütun üzerine glisin HCI hacmi başka ekleyin. Bir 15 ml tüp içinde ortaya çıkan akış toplayın ve 0.5 M Tris-HCI, pH 8.0 ile pH 7.3 'e ayarlayın.
Sütun yenilemek için, 3 plazma hacimleri glisin HCl ile yıkayın. 2 hacim% 0.9 NaCl ile bir son yıkamadan sonra, sütun sonraki plazma örneği için kullanılabilir. ° C ila 4 hafta için 8 - Alternatif olarak, kolon koruma çözeltisi ile doldurulmuş ve 4 de muhafaza edilebilir.
Kardiyomiyositlerde üzerinde kullanım için, toplanan IgG fraksiyonu deneme tamponu (EB) karşı diyaliz gerekmektedir. EB hazırlanması için, 117 mM NaCI, 2.8 mM KCI, 0.6 _mM MgCl2, 1.2 mM KH ₂ PO _4, 1.2 _mM CaCl2, 10 mM HEPES ve bir manyetik karıştırıcı üzerinde, 20 mM glikoz 1 L damıtılmış suya eklenir ve pH ayarlamak 7.3.
100 kDa kesilmiş olan bir molekül ağırlığına sahip olan bir selüloz ester diyaliz zarı tüp için IgG fraksiyonu doldurun. 1 L EB tüp koyun ve 4'e bir manyetik karıştırıcı ile yavaş yavaş karıştırılır ° C. 8 saat sonra, taze EB 3 L diyaliz tüpü içine aktarmak ve 4'de diğer bir 20 saat boyunca dialyze ° C.
Inactivat için bir su banyosu içinde 30 dakika 57 ° C'de diyaliz için, ısı örnek takibene kompleman faktörleri. Total IgG konsantrasyonunu belirleyin ve 330 mikrogram IgG içeren her alikotları hazırlamak. Ölçümü (adım 4.3) için kardiyomiyositlerde için örnek eklerken, EB ile 1 ml alikotları kadar doldurun. Seyreltilmemiş alikotları daha fazla kullanıma kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

2. Sıçan kardiyomiyositlerde izolasyonu

^{Ca2 +-serbest} izolasyon tampon (IB) hazırlanması için, 110 mM NaCI, 2.6 mM KCI, 1.2 mM _MgSO4, 1.2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM HEPES ve bir manyetik kullanılarak 1 L damıtılmış su ile 11 mM glükoz eklemek karıştırıcı. Sterilizasyon için 0.2 mikron şişe üst filtre ile oda sıcaklığında ve filtre, 7.4 pH ayarlayın.
Termostatlı bir Langendorff perfüzyon sisteminin üst rezervuar içinde IB 80 ml doldurun. 37 ° C arasında bir sıcaklık muhafaza tampon ve% 95 _O2 /% 5 30 dakika için _CO2 ile tampon havalandırmak için termostat ayar ayarlayın.
Yaklaşık 10.000 tartılır - collag 12.000 Uenase tip II, 175 mg yağ asidi serbest BSA ve 100 _mM CaCl2 stok solüsyonu 22.5 ul içeren 20 ml'lik IB içinde çözülür. Üst rezervuar içinde tecrit tampon pH kontrolü ve gerekirse ayarlanır.
375 mg / kg vücut ağırlığı tiyopental ile 200 gr - 175 bir Wistar sıçan Anesteziyoloji. Tiyopental çözümü 2500 IU Heparin ekleyin. Sağlam bir aort arkı ile dikkatlice torakotomi, tüketim kalp sonra ve buz gibi soğuk% 0.9 NaCl içine aktarın. Kan kalp ve çevresindeki doku ve taze% 0.9 NaCl transfer temizleyin. Aorta Açığa, 2-3/sec bir damla hızını elde etmek ve kanül için kalp eklemek Langendorff sistemin akışını düşürücü açın.
Kadar kalan kan dışarı yıkamak 1 damla / sn debi ile 3 dakikaya kadar kalp serpmek. Langendorff sisteminde IB dolaşmaya başlayın. Üst rezervuar 20 ml tampon kaldır gibi 80 ml ulaşmak için gerekli çok tampon kollajenaz çözüm ve dolum doldurun. C sirküle Başka bir 27 dakika için çözelti ollagenase. Akış hızı Akış redüktör kullanarak 1 damla / sn aralıklarla kontrol ve muhafaza edilmelidir.
Kulakçıklar ve aortadan temiz kanül gelen kalp, ayırın ve küçük parçalar halinde doğrayın. Kollajenaz çözüm alt rezervuar içine çalıştırmak için izin ver, 40 ml, maksimum hacmi azaltmak ve daha 10 için kıyılmış ventriküller sindirmek -% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ile sürekli havalandırma altında 15 dk. Daha sonra, bir 50 ml tüp içinde bir 200 mikron elek gazlı bez ile hücre süspansiyonu filtre.
200 uM _CaCl2 içeren 10 ml IB içinde oda sıcaklığı ve tekrar süspansiyon hücreler 2 dakika için 43 x g'da hücre süspansiyonu santrifüj: 3 adım hücrelerin Ca ^{2 +} içerik yükler. Tekrar santrifüjlenir ve 500 uM _CaCl2, 10 ml IB hücreleri tekrar süspansiyon. Son bir santrifüj 50.000 hücre / ml 'lik bir yoğunluğa steril filtre edilmiş EB kardiyomiyositlerde (1.8 bakınız) tekrar süspansiyon sonra.

kardiyomiyositlerin "> 3 E_TITLE. Fura-2 Boyama

Coat 10 mikrogram başına iyi laminin ve tamamen kurutulur beklemek bir 4 iyi odacıklıdır coverglass.
Her iyi bir kesim uçlu bir mikropipet kullanarak içine kardiyomiyosit süspansiyonu 1 ml doldurun. Hücreler, oda sıcaklığında 1 saat boyunca uymak için izin verin.
10, 1 mg / ml 'lik ul Fura-2 5 ml EB stok çözelti AM. Seyreltilir Karanlıkta boyama çözüm tutun.
Coverglass ve her kuyuya boyama çözeltisi pipetle 0.5 ml tampon ve bekâr hücreleri çıkarınız. Sarsıntı orta altında 10 dakika için hücreler inkübe edin. Daha sonra, boyama çözüm take off 1 ml EB ile bir kez hücreleri yıkayın ve nihayet her oyuğuna 0.5 ml EB doldurun. Boyama işlemi sırasında doğrudan ışıktan sakının ve her zaman karanlıkta boyanan hücreleri tutun.

4. Hücre kısaltılması ve Ca ^{2 +} Geçişlerine kaydedilmesi

Ters floresan m odacıklı coverglass yerleştirinicroscope bir miyosit kalsiyum ve kontraktilite kayıt sistemine bağlı. De ilk akını ve akış tüpü ile özel yapılmış elektrot yerleştirin. 1 ml / dak EB ve (20 V, 1 Hz, 5 ms süre), elektrik uyarımı ile başlamak Superfuse kardiyomiyositlerde. Hücrelerin yaklaşık 2 dakika stimülasyon uyum sağlayın.
Net çizgili ve sürekli kasılma ile sağlam bir çubuk şekilli kardiyomiyosit seçin. Görüş alanının merkezinde hücre yerleştirin ve kamera kanal açılır. Hücre çerçeveleme adaptörü dönen ve mikroskop sahne hareket ettirerek videoyu alanı içinde yatay hücre yönlendirilmesi.
Başlangıç hücre kısalma ve Ca ^{2 +} geçici elde etmek için 15 kasılmalar - kenarı video alanı kontrol elemanları (Şekil 2) tespit ayarlayın, floresan kanal ve kayıt 10 açın.
Floresans leke ağartma önlemek için mikroskop ışık kanalı kapatın. Örnek EB aracılığıyla akışını değiştirmeHastanın IgG 1 ml ile 3-yollu vana ve superfuse kardiyomiyositlerde ile bypass. Hava iyi ulaşmadan hemen önce pompayı durdur.
Işık kanalı açın ve başka bir 10 kayıt - Akut hücre yanıtını elde etmek için 15 kasılmalar. Kayıt dondurularak ve tekrar ışık kanalı kapatın. 2'den sonra kayıt ve 5 dk tekrarlayın.
Kuyunun elektrot çıkarın. EB ile iyice temizleyin ve tüpler odacıklı coverglass bir sonraki sıra ile devam edin.
Sırasıyla Hücre kısalma ve Ca ^{2 +} "Edge-Length/Length" kullanarak IonWizard yazılımı ile geçici ve "fura 2-Sayısal / Oranı çıkarılır" penceresinde, analiz edin. Başlangıç hücre kısalma ve Ca ^{2 +} Akut için temel (bl% pik h) atıfta pik yüksekliği geçici, 2 dakika ve 5 dk yanıtı yüzde değişim hesaplayın.